Biochemical and structural features of the catalytic domain of cellulase CelE2 and its relation with the Calx-beta accessory domain

Orientadores: Fabio Marcio Squina, Thabata Maria AlvarezDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: As glicosil hidrolases (GHs) compõem uma classe de enzimas amplamente utilizadas nos processos enzimáticos por atuarem na hidrólise das ligações glicosídicas de polissacarídeos. Além do domínio catalítico, diversas GHs apresentam domínios acessórios que podem influenciar diversos aspectos bioquímicos e estruturais das enzimas. A celulase CelE2 de origem metagenômica, caracterizada recentemente, apresenta em sua estrutura um domínio catalítico N-terminal característico da família GH5 e um domínio C-terminal com identidade para o domínio Calx-beta, previamente identificado em outras GHs mas sem função claramente definida nestes casos. Com o intuito de investigar as características bioquímicas e estruturais dos domínios de CelE2 separadamente, foram construídas derivações truncadas referentes ao domínio catalítico e ao domínio acessório Calx-beta. Como resultados, observou-se que a excisão do domínio acessório Calx-beta (CelE2382-477) não provocou alterações nas características bioquímicas de CelE2, visto que o domínio catalítico (CelE21-381) apresentou valores semelhantes de atividade enzimática em beta-glucano, carboximetilcelulose e liquenana, valores de pH e temperatura ótimos próximos de 5,3 e 45 ºC, respectivamente, estabilidade térmica a 40 ºC e 50 ºC por 360 minutos e aumento de atividade enzimática na presença de CaCl2. O perfil de degradação e as evidências de transglicosilação também foram mantidas após a excisão do domínio acessório Calx-beta. No entanto, o domínio catalítico apresentou um aumento de cerca de 4 vezes da atividade enzimática na hidrólise de Avicel, comparado à CelE2. As análises por dicroísmo circular (CD) de CelE21-381 indicaram um perfil predominante de alfa-hélice, diminuição de 4,6 ºC da temperatura de desnaturação e um aumento destes valores na presença de CaCl2, tanto para a construção completa, quanto para CelE21-381. Assim como para CelE2, as análises por espalhamento de raio-X de baixo ângulo (SAXS) mostraram que a adição de CaCl2 resultou na diminuição da tendência de agregação proteica para CelE21-381. Os ensaios de avaliação da ligação a polissacarídeos solúveis e insolúveis indicaram que CelE2382-477 não apresentou capacidade de ligação para os substratos testados. A estrutura tridimensional do domínio catalítico CelE21-381 foi determinada a uma resolução de 2,1 Å que permitiu a identificar um enovelamento do tipo barril (alfa/beta)8. Os resultados obtidos mostraram que a presença do domínio acessório Calx-beta não é fundamental para atividade enzimática de CelE2, de modo que a alteração mais significativa diz respeito ao aumento da atividade enzimática do domínio catalítico em Avicel em comparação à construção completa. Estes resultados contribuirão para estudos futuros acerca deste domínio pouco estudado entre as celulases e informações para a família 5 das GHsAbstract: Glycoside hydrolases (GHs) comprise a class of enzymes widely used in the enzymatic processes, acting in the hydrolysis of the polysaccharides glycosidic bonds. In addition to the catalytic domain, several GHs present accessory domains, which may influence the biochemical and structural aspects of the enzymes. The CelE2, a metagenomic-derived cellulase, recently characterized, harbors in its structure an N-terminal catalytic domain characteristic of the GH5 family, and a C-terminal domain with identity for the Calx-betadomain, previously identified in other glycoside hydrolases but without clearly defined function in these cases. In order to investigate the biochemical and structural characteristics of the CelE2 domains separately, truncated derivations were constructed regarding the catalytic domain and the accessory domain Calx-beta. The results showed that the deletion of Calx-beta domain (CelE2382-477) did not cause alterations in the biochemical characteristics of CelE2, since the catalytic domain (CelE21-381) presented similar values of enzymatic activity in beta-glucan, carboxymethylcellulose and lichenan, optimal pH and temperature values near 5,3 and 45 ºC, respectively, thermal stability at 40 ºC and 50 ºC up to 360 minutes, and increase of enzymatic activity in the presence of CaCl2. The cleavage pattern and evidence of transglycosylation were also maintained after Calx-beta deletion from CelE2. However, the catalytic domain showed a 4-fold increase in the enzymatic activity of Avicel hydrolysis, compared to CelE2. Circular dichroism (CD) analysis of CelE21-381 indicated a predominant alpha-helix profile, decrease in the denaturation temperature around 4.6 ºC and an increase of these values in the presence of CaCl2, both for the complete construct and for CelE21-381. As well as CelE2, small angle X-ray scattering (SAXS) analyzes showed that the addition of CaCl2 resulted in a decrease in the protein aggregation tendency for CelE21-381. The binding assays for soluble and insoluble polysaccharides indicated that CelE2382-477 did not show the binding ability for the substrates tested. The three-dimensional structure of the catalytic domain CelE21-381 was determined at a resolution of 2.1 Å which allowed to identify an (alpha/beta)8 barrel fold. The results showed that the presence of the accessory domain Calx-beta is not fundamental for the enzymatic activity of CelE2, so that the most significant change concerns the increase of the enzymatic activity of the catalytic domain in Avicel, comparing to the whole construct. These results may contribute to future studies about this understudied domain among cellulases and information for the family 5 of glycoside hydrolasesMestradoBioquimicaMestra em Biologia Funcional e Molecular132372/2016-92016/01926-2FAPESPCNP