Construction of a collection of microorganisms representative of the sugarcane microbiome

Orientador: Paulo ArrudaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O ecossistema formado pela interação entre plantas e solo é composto por uma imensa diversidade de microorganismos que desafiam abordagens de estudos quanto as suas características e mecanismos de associação. Métodos tradicionais de isolamento, cultivo e identificação de microorganismos em coleções são laboriosos, de alto custo e consumem grande parcela de tempo. Neste trabalho utilizamos amostras de raiz, rizosfera e colmo da cana-deaçúcar para obtenção dos microorganismos associados. A partir disso, descrevemos uma nova metodologia para construção de uma coleção de microorganismos representativa do microbioma da cana-de-açúcar baseado em um sistema de obtenção de culturas. Este método é baseado em picar colônias de placas de cultura que podem conter um ou múltiplos microorganismos, armazenando-as em placas de 96 poços. Foram usados diferentes meios de cultura, suplementação com xarope de cana-de-açúcar e diferentes temperaturas de incubação em estufa para obtenção de uma ampla diversidade de microorganismos. A coleção completa é composta de 56 placas de 96 poços. Para identificação das bactérias presentes na coleção, foi desenvolvido um sistema multiplex para a amplificação do gene correspondente ao RNA ribossomal 16S constituído por duas etapas de amplificação por PCR com primers contendo barcodes para placas, linhas e colunas que permitiram identificar e rastrear o conteúdo bacteriano de cada poço independentemente do mesmo conter um ou múltiplos microorganismos. O sistema multiplex permite o agrupamento dos amplicons em um único tubo. O sequenciamento foi feito através da plataforma PacBio e permitiu a obtenção de sequências de tamanho quase completo do gene 16S que permitiu uma identificação acurada de cada poço. Comparando os dados obtidos para a coleção de microorganismos (dependente de cultivo) com o perfil do microbioma da cana (independente de cultivo) conseguimos obter 399 bactérias cultivadas que representam 15,9% do microbioma core da rizosfera e 61,6-65,3% dos representantes do microbioma core de colmo. Os resultados mostram que a metodologia utilizada para construção da coleção de microorganismos teve êxito em nosso objetivo de propor uma nova abordagem para obtenção de microorganismos benéficos para plantas a partir de seu microbiomaAbstract: The soil-plant ecosystem harbors an immense microbial diversity that challenges investigative approaches to study traits underlying plant-microbe association. Traditional methods for isolation, cultivation and identification of microbes on culture collections are time-consuming, laborious and expensive. Here we describe a novel methodology for constructing a microorganism collection representative of the sugarcane microbiome based on a community-based system. We used samples of root, rihizosphere and stalks of sugarcane to obtain the associated microorganisms. The method is based on picking colonies from primary platings that may contain one or multiple microorganisms and storaging the cultures on 96 well plates. We used diferent culture media, supplementation of sugarcane juice and different temperatures of incubation to obtain a broad range of microorganisms. The total culture collection comprises 56 plates of 96 wells. For identification of the bacterial content of the collection we developed a multiplex system for amplification of 16S RNA gene on a two-step PCR amplification with tagged primers for plates, rows and collums witch permited to identificate and track back the well contents regardless if the well contained single or multiple microorganisms. The multiplex systems enables to pooling amplicons on a single tube. The sequencing was performed on PacBio platform and led to recovery of near-full-lenght 16S rRNA gene sequences allowing accurate identification of microorganisms in each plate well. By cross-referencing the collection of microorganisms (culture-dependent) with the sugarcane microbiome profile (culture-independent) we were able to recover 399 unique bacteria representing 15.9% of the rhizosphere core microbiome and 61.6¿65.3% of the endophytic core microbiomes of stalks. The results demonstrate that the methodology used to construct the microbial collection successfully provide a new approach to recover beneficial plant microbes from plant microbiotaMestradoGenetica Vegetal e MelhoramentoMestra em Genética e Biologia Molecula