Proteina desacopladora de plantas : efeito do estresse oxidativo na sua expressão e atividade e reconstituição funcional da isoforma de Arabidopsis thaliana

Orientador: Anibal E. VercesiTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: O presente trabalho está dividido em duas partes: a reconstituição funcional de uma proteína desacopladora de Arabidopsis thaZiana e a medida da expressão e da atividade de uma proteína desacopladora em resposta a diversos estresses abióticos. A expressão do gene AtPUMPl em Saccharomyces cerevisae e Escherichia coZi permitiu a confirmação de que este gene realmente codifica uma proteína desacoplado~ capaz de dissipar energia do gradiente eletroquímico de Ir. Num ambiente termoneutro (28°C), células expressando a AtPUMPl cresceram mais lentamente que células controle, enquanto sob baixa temperatura (14 °C) a taxa de crescimento de ambas as células foi semelhante. Quando expressa em um sistema procariótico e reconstituída em vesículas lipídicas, a AtPUMPl mostrou características cinéticas semelhantes às descritas para as outras proteínas desacopladoras. O transporte de Ir foi induzido por diferentes ácidos graxos, de uma maneira dependente do tamanho da cadeia de carbonos e do número de insaturações na mesma. Este transporte de Ir foi inibido por nucleotídeos de purina, sendo que mudanças no pH do meio externo alteraram a afinidade da AtPUMPl por nucleotídeos. Através dos experimentos de reconstituição, verificamos que as constantes de afinidade e velocidade máxima de transporte (Km e V máx) são similares às obtidas para outras proteínas desacopladoras vegetais e também para as UCP2 e 3. A expressão e a atividade da proteína desacopladora também foi estudada em situações de estresse abiótico, como excesso de sal, temperatura baixa e atmosfera hiperoxigenada, situações que sabidamente geram estresse oxidativo. Em coleóptiles de milho, a expressão do mRNA para a proteína desacopladora aumenta durante o estresse salino e permanece inalterada durante o estresse por mo. Entretanto, a expressão da proteína e a disponibilidade de substratos aumentaram significativamente nos dois casos, sugerindo uma regulação pós-transcripcional para este gene. Observamos ainda que mitocôndrias isoladas de coleóptiles de milho submetidos a estresse salino e por frio possuem uma razão ADP/O diminuída, que retoma para níveis controle na presença de BSA ou GTP. Em situações de aumento intracelular de Ca2+, observamos também que ativadores da proteína desacopladora inibem a geração mitocondrial de EAOs e que seus inibidores aumentam esta geração. Considerando os resuhadqs aqui apresentados, podemos, portanto, concluir que a AtPUMPl é uma verdadeira proteína desacopladora, capaz de afetar o crescimento celular, induzindo um desacoplamento mediado por ácidos graxos e inibido por nucleotídeos de purina. É possível sugerir ainda que a proteína desacopladora desempenhe um papel importante em situações de estresse abiótico, diminuindo a geração mitocondrial de EAOs de fonna a proteger o organismo do estresse oxidativo resultanteAbstract: The present work is divided in two parts: the functional reconstitution of the Arabidopsis thaZiana uncoupling protein 1 (AtPUMPI) and the expression and activity of the uncoupling protein under several abiotic stresses. AtPUMPI expression in Saccharomyces cerevisae and Escherichia coZi allowed us to confirm that this gene codes for a true uncoupling protein, able to divert energy of the proton electrochemical gradient. In a thermoneutral environment (28°C), AtPUMPI expressing cells grew slower than control cells, while under low temperatures (14 °C) growth rates were similar. When expressed in a prokaryotic system and reconstituted in lipid vesicles, AtPUMPI showed similar biochemical patterns to those already described for other uncoupling proteins. Ir transport was induced by severa! fatty acids and was dependent on the length and insaturations of the alkyl chain of the substrates. Pmine nucleotides were able to inhibit this proton transport, while changes in external pH alter AtPUMPl affinity for the nucleotides. Reconstitution experiments helped us to determine the Km and the Vmax for AtPUMPl. The values are within the physiologicallevels and very similar to those already obtained for other uncoupling proteins. We also studied the expression and activity of the uncoupling protein under situations of abiotic stresses, such as salinity, low temperature (chilling) and hyperoxygenated atmosphere. These situations are known to generate an oxidative stress. In maize coleoptiles, ZmPUMP mRNA expression increases under salt stress and does not change under chilling. However, protein expression and availability of substrates increased significantly on both situations, suggesting a post - transcriptional regulation for this gene. Moreover, mitochondria isolated ftom salt and cold stressed maize coleoptiles showed smaller ADP/O ratio, which returns to controllevels in the presence of BSA or GTP. In tomatoes submmited to a hyperoxygenated atmosphere, PUMP concentration and AOX activity patterns were similar to those already described for post-harvest ripening. However, preliminary experiments show increase in lipid peroxidation, resulting in a release of ftee fàtty acids, and consequent AOX inhibition and PUMP activation, even with a decrease in PUMP protein contento Under situations ofhigh intracellular Ca2+, we are able to observe also that uncoupling protein activators inhibit the mitochondrial generation of Reactive Oxygen Species (ROS) and that its inhibitors increased this generation. Considering all the above results, we ean conelude that AtPUMPI is a true uneoupling protein able to influenee eell growth through an uncoupling mechanism mediated by fatty aeids and inhibited by purine nucleotides. It is also possible to suggest that plant uneoupling proteins have a signifieant role under abiotic stress situations, decreasing mitoehondrial ROS generation and thus proteeting the tissue ttom the resulting oxidative stressDoutoradoCiencias BiomedicasDoutor em Ciências Médica