Biochemical and pharmacological characterization of venom from Leptodeira annulata (Colubridae, Dipsadinae, Leptodeirini)

Orientador: Stephen HyslopDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A composição e as propriedades das peçonhas da maioria das serpentes da família Colubridae são pouco conhecidas, embora o interesse nestas secreções tenha aumentado consideravelmente nos últimos anos. Neste trabalho, investigamos o perfil bioquímico e algumas atividades biológicas da peçonha de Leptodeira annulata, espécie com ampla distribuição nas Américas. O perfil eletroforético da peçonha em SDS-PAGE mostrou que a maioria das bandas têm massas moleculares de 30-70 kDa. A zimografia revelou várias bandas de atividades caseinolítica e gelatinolítica. A atividade caseinolítica foi muito semelhante à de B. moojeni e maior que a de B. jararacussu, com pH e temperatura ótimos de 8,0 e 37 ºC, respectivamente. Esta atividade foi fortemente inibida por EDTA (ácido etilenodiaminotetraacético) e 1,10-fenantrolina, mas não por PMSF (fluoreto de fenilmetilsulfonil) ou AEBSF (fluoreto de 4-2-aminoetil benzenosulfonil). A peçonha não mostrou atividade contra BApNA (n-benzoil-L-arginina p-nitroanilida) e foi mais ativa sobre o substrato natural elastina- Congo vermelho de que sobre o substrato sintético n-t-boc-L-alanina p-nitrofenil éster; houve pouca atividade sobre o hide powder azure. A peçonha mostrou moderada atividade fosfolipásica comparada às peçonhas de Bothrops spp. O perfil cromatográfico da peçonha em RP-HPLC apresentou 34 picos. A peçonha não coagulou o plasma citratado de ratos ou o fibrinogênio purificado, porém atenuou a extensão da coagulação em ~30% e atrasou o tempo de recalcificação do plasma em ~3 min. Também degradou a cadeia ? do fibrinogênio purificado, enquanto que a cadeia ? e a cadeia ? não foram afetadas, conforme avaliado por SDS-PAGE. Essa atividade fibrinogenolítica foi inibida por EDTA e 1,10-fenantrolina (10 mM), mas não por inibidores de serinoproteases (AEBSF, PMSF), indicando que as metaloproteases foram responsáveis por essa atividade. O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) mostrou que a peçonha reagiu mais com o antisoro botrópico gerado contra Bothrops spp., seguido de antissoro elapídico (Micrurus spp.) e antisoro crotálico (Crotalus durissus terrificus). A dose hemorrágica mínima no rato foi de 95,8 µg e esta atividade foi atenuada pelo EDTA e 1,10-fenantrolina. A peçonha causou miotoxicidade em músculo esquelético de camundongo aumentando os níveis plasmáticos de CK e causando alterações histopatológicas. A peçonha também produziu relaxamento concentração-dependente de anéis de aorta e de artéria mesentérica de ratos, sendo esse último muito menos sensível. O efeito relaxante em aorta foi parcialmente inibido pela remoção do endotélio, pelo tratamento da peçonha com EDTA e pela pré-incubação dos anéis com indometacina, ODQ (1H-1,2,4 oxadiazolol 4,3-a quinoxalin-1-one) e L-NAME. Estes achados indicaram o envolvimento de pelo menos duas vias de sinalização na vasodilatação, uma envolvendo a via de óxido nítrico (NO)/guanilato ciclase solúvel (GCs)/GMPc e outra envolvendo metabólitos do ácido araquidônico. A liberação destes mediadores pode envolver a ação de SVMPs e PLA2 da peçonha ou endógenas, sem, porém, afetar a integridade do tecido. A peçonha não causou alterações nos parâmetros hemodinâmicos de ratos (6 mg/kg, i.v.), mas causou alterações histopatológicas nos pulmões de ratos (hemorragia, formação de trombos e inflamação) sem afetar o fígado, rim e coração. Estes resultados indicam que a peçonha de L. annulata exerce várias atividades biológicas, a maioria das quais parece ser mediada por SVMPs da peçonhaAbstract: The venom composition and properties of most snakes of the family Colubridae are largely unknown, although interest in these secretions has increased considerably in recent years. In this work, we investigated the biochemical profile and some biological activities of the venom of Leptodeira annulata, a species with a wide distribution throughout the Americas. SDS-PAGE of L. annulata venom showed that most of the protein bands has molecular masses of 30-70 kDa. Zymography revealed caseinolytic and gelatinolytic activities in various protein bands. The caseinolytic activity of L. annulata venom was very similar to that of B. moojeni and greater than that of B. jararacussu, with pH and temperature optima of 8.0 and 37 ºC, respectively. This activity was strongly inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (metalloproteinase inhibitors), but not by PMSF or AEBSF (serine protease inhibitors). The venom was more active towards the natural substrate elastin-Congo red than towards the synthetic substrate n-t-boc-L-alanine p-nitrophenyl ester, and showed low PLA2 activity compared to Bothrops venoms. The venom was not very active towards hide powder azure and did not degrade BApNA and TAME, two esterase substrates. RP-HPLC of the venom resulted in 34 peaks. The venom (10 ?g) did not clot rat citrated plasma even after 5 min at 37 ºC, whereas B. atrox venom (10 ?g) clotted citrated plasma in 49±12 s (mean±SD; n=6). The venom reduced the extent of coagulation by ~30% and prolonged the plasma recalcification time by ~3 min. The latter finding agreed with the ability of venom to degrade the A?-chain of purified fibrinogen, whereas the B?-chain and ?-chain were not affected, as assessed by SDS-PAGE. This fibrinogenolytic activity was inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (10 mM) but not by PMSF and AEBSF (10 mM), indicating that metalloproteases but not serine proteases were involved. ELISA showed that L. annulata venom reacted most with antivenom raised against Bothrops spp., followed by coral snakes (Micrurus spp.) and rattlesnakes (Crotalus durissus terrificus). The minimum hemorrhagic dose in rats was 95.8 µg and this activity was inhibited by EDTA and 1,10-phenanthroline (10 mM). The venom caused concentration-dependent relaxation of aortic rings and relaxed mesenteric artery rings, being much less sensitive. The relaxing effect was partially inhibited by removal of the endothelium, the treatment of venom with EDTA, and the pre-incubation of rings with indomethacin, ODQ (inhibitor of soluble guanylate cyclase) and L-NAME (inhibitor of nitric oxide synthase). These findings indicated that at least two pathways (NO/GC/GMPc signaling and arachidonic acid metabolite formation) were involved, at least partially via the action of metalloproteinases and possibly PLA2; the venom had no effect on vessel reactivity (intactness). The venom did not cause any hemodynamic alterations in anesthetized rats at doses up to 6 mg/kg, i.v. However, histopathological alterations (hemorrhage, thrombus formation and inflammation) were observed in rat lungs, but not in liver, kidney and heart. These findings indicate that L. annulata venom exerts a variety of biological activities that are mediated primarily by venom metalloproteinases and possibly by PLA