Administration of riluzole, tempol and mesenchymal stem cells in treatment of ALS in SOD1G93A mice

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de OliveiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A esclerose lateral amiotrófica é uma doença neurodegenerativa caracterizada pela perda seletiva e progressiva de neurônios motores na medula espinal, tronco encefálico e córtex motor. Resulta em progressiva atrofia e consequente paralisia muscular, levando o paciente a óbito, geralmente entre 2 a 5 anos após o início dos sintomas. Apesar de sua etiologia ser complexa e pouco conhecida, acredita-se que, a exemplo do que ocorre em outras doenças neurodegenerativas, o mecanismo patológico subjacente da ELA seja um conjunto de alterações celulares e bioquímicas que acabam por desencadear a degeneração dos motoneurônios. Apesar do resultado final da doença ser a morte neuronal, sabe-se hoje que a ELA é uma doença não autônoma com participação ativa de astrócitos, micróglia e células T como protagonistas da neuroinflamação, um dos principais e mais evidentes mecanismos patogênicos envolvidos na doença. O tratamento farmacológico com riluzol não é curativo e exerce pouco efeito na prorrogação da sobrevida dos pacientes. Assim, é de máxima importância o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas visando promover melhor qualidade de vida aos pacientes. Como alternativa, existe a perspectiva do uso de nitróxidos cíclicos como o tempol, uma vez que são antioxidantes multifuncionais que apresentam baixa toxicidade em animais experimentais. Além de terapias farmacológicas, ouso de células-tronco vêm sendo fortemente investigado, buscando efeitos imunomodulatórios e neuroprotetores. O objetivo deste estudo foi verificar se a interação entre riluzol, tempol e células-tronco mesenquimais apresenta potencial terapêutico em camundongos transgênicos SOD1G93A. Os tratamentos tiveram início na fase assintomática da doença (10a semana). O tratamento com riluzol (8mg/kg) e tempol (50mg/kg) foi realizado em dias alternados até a 14° semana e, a partir daí, até o estágio final da doença, duas vezes por semana. Já a aplicação sistêmica (1x105) de células-tronco mesenquimais humanas (hMSC) derivadas de tecido adiposo, ocorreu uma única vez. Os animais foram eutanasiados na 14a semana (estágio inicial dos sintomas - EIS) e no estágio final (EF) da doença para a coleta das amostras e análise dos dados. A medula lombar dos animais foi dissecada e processada para as seguintes técnicas: coloração de Nissl para avaliação da sobrevivência neuronal, imunoistoquímica para avaliar astrogliose, microgliose e alterações sinápticas (EIS e EF); qRT-PCR para avaliação da expressão de fatores neurotróficos e citocinas pró e anti-inflamatórias (EIS) e, microscopia eletrônica de transmissão para avaliação ultraestrutural dos motnoneurônios alfa (EF). As análises comportamentais considerando-se o início da doença, progressão e sobrevida dos animais, através da avaliação do score neurológico, monitoramento do peso corporal e teste de desempenho motor Rotarod, tiveram início na 10a semana e foram realizados a cada 3 dias até o estágio final da doença. Os resultados revelaram que o tratamento com tempol e hMSC promoveu maior sobrevivência neuronal (23% e 44% respectivamente) no EIS da doença, quando comparados aos animais do grupo veículo. No entanto, esse efeito só foi evidenciado no EF da doença no grupo tratado com tempol. A maior sobrevivência neuronal observada no EIS foi acompanhada por uma maior preservação de circuitos sinápticos no corno ventral da medula desses animais. Porém, no estágio final houve perda de ~80% das sinapses em todos os grupos experimentais, quando comparados aos animais não transgênicos (NTG; p<0,0001). A intensa reatividade de astrócitos e micróglia observada nos animais veículo, quando comparados aos NTG, foi reduzida na medula lombar dos animais tratados com tempol, hMSC e hMSC+tempol, sendo evidenciada no grupo hMSC quando comprado ao tempol. O efeito neurprotetor dos tratamentos com tempol e hMSC sob a inflamação foram contínuos, até o EF da doença. Além da menor reatividade das células gliais, os grupos tratados com tempol e hMSC reduziram em ~8× a expressão de citocinas pró-inflamatórias (IL1beta e TNFalfa) e ~3× a expressão de TGFbeta (anti-inflamatória) no EIS, quando comparados com o grupo veículo. Todos esses efeitos somados resultaram em atraso no déficit motor e reduziram a perda de peso desses animais quando comparados aos animais veículo. Adicionalmente, os grupos que receberam a terapia celular sozinha ou associada ao tempol, retardaram a evolução da doença o que refletiu significativamente em um aumento de 18 dias na sobrevida dos animais. Em conjunto, nossos resultados indicaram que o tratamento com tempol, bem como a terapia celular com hMSC, apresentam efeitos benéficos, aumentando a sobrevivência neuronal, preservando sinapses e diminuindo a reatividade das células gliais durante a progressão da ELA, além de reduzir os níveis de citocinas pró-inflamatórias na medula, podendo ser considerados promissoras terapias para promover maior qualidade de vida aos pacientes e/ou prorrogar o tempo de sobrevida dos mesmosAbstract: Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disease characterized by the selective and progressive loss of motor neurons in the spinal cord, brain stem, and motor cortex. It results in progressive atrophy and consequent muscular paralysis, leading the patient to death, usually between 2 and 5 years after the onset of symptoms. Although its etiology is complex and little known, it is believed that, as in other neurodegenerative diseases, the underlying pathological mechanism of ALS is a set of cellular and biochemical alterations that end up triggering the degeneration of the motoneurons. Although the end result of the disease is neuronal death, it is known today that ALS is a non-autonomous disease with the active participation of astrocytes, microglia and T cells as protagonists of neuroinflammation, one of the main and most evident pathogenic mechanisms involved in the disease. Pharmacological treatment with riluzole is not curative and has little effect on the prolongation of patient survival. Thus, the development of new therapeutic strategies aimed at promoting a better quality of life for patients is of utmost importance. As an alternative, there is the prospect of the use of cyclic nitroxides such as tempol, since they are multifunctional antioxidants that present low toxicity in experimental animals. In addition to pharmacological therapies, the use of stem cells has been heavily investigated, seeking immunomodulatory and neuroprotective effects. The objective of this study was to verify if the interaction between riluzole, tempol and mesenchymal stem cells presents therapeutic potential in SOD1G93A transgenic mice. The treatments started in the asymptomatic phase of the disease (10th week). Treatment with riluzole (8mg/kg) and tempol (50mg/kg) was performed on alternate days until the 14th week and from there to the final stage of the disease, twice a week. On the other hand, the systemic application (1x105) of human mesenchymal stem cells (hMSC) derived from adipose tissue occurred only once. The animals were sacrificed at the 14th week (initial stage of symptoms - ISS) and at the end stage (ES) of the disease for sample collection and data analysis. The lumbar spinal cord of the animals was dissected and processed for the following techniques: Nissl staining for evaluation of neuronal survival, immunohistochemistry to evaluate astrogliosis, microgliosis and synaptic changes (ISS and ES); qRT-PCR to evaluate the expression of neurotrophic factors and pro-inflammatory cytokines (ISS) and transmission electron microscopy for the ultrastructural evaluation of the alpha motoneurons (ES). Behavioral analyzes considering the onset of disease, progression and survival of the animals through evaluation of the neurological score, body weight monitoring and Rotarod motor performance test, started on the 10th week and were performed every 3 days until the stage end of the disease. The results revealed that treatment with tempol and hMSC promoted greater neuronal survival (23% and 44%, respectively) in the disease ISS when compared to animals in the vehicle group. However, this effect was only evidenced in the ES of the disease in the group treated with tempol. The higher neuronal survival observed in the ISS was accompanied by a greater preservation of synaptic circuits in the ventral horn of the spinal cord of these animals. However, in the final stage, there was ~ 80% loss of synapses in all experimental groups when compared to non-transgenic animals (NTG; p