The DNA methylation in HeLa cells after valproic acid treatment

Orientadores: Maria Luiza Silveira Mello, Benedicto de Campos VidalDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O ácido valproico (VPA) é um antiepiléptico de uso bem estabelecido que também é reconhecido como inibidor de deacetilases de histonas (HDAC), induzindo hiperacetilação de histonas H3 e H4. Adicionalmente, tem sido sugerido papel do VPA na demetilação do DNA em diversos tipos celulares, possivelmente de maneira ativa e independente do processo de replicação. O presente trabalho estudou os efeitos do VPA sobre a abundância de 5-metilcitosina (5mC) e elementos das vias de demetilação do DNA em células HeLa, comparado à ação da droga de conhecida ação demetilante, 5-aza-2¿-deoxicitidina (5-aza-CdR). Foi também investigada a possível contribuição da ação demetiladora do DNA pelo VPA na remodelação da cromatina previamente atribuída à inibição de HDAC neste tipo celular, bem como os impactos de possíveis alterações induzidas pelo VPA nas marcas de 5mC sobre o perfil espectral do DNA ao infravermelho. Em células tratadas com VPA e 5-aza-CdR, os níveis de metilação do DNA foram avaliados por imunocitoquímica e ELISA. Os derivados da citosina 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-carboxilcitosina (5caC) e 5-formilcitosina (5fC) foram investigados por imunocitoquímica. Em paralelo, PCR quantitativo em tempo real foi realizado para acessar informações a respeito dos níveis de expressão gênica da DNA metiltransferase 1 (DNMT1) e de enzimas da família das ten-eleven-translocation (TET), TET1 e TET2, além de Western blotting para medir os níveis proteicos de DNMT1 e TET2. Ensaios ao microespectrofotômeto de varredura foram realizados a fim de constatar alterações na supraorganização cromatínica de células HeLa tratadas com VPA e perfis espectrais do DNA foram obtidos por microespectroscopia no infravermelho por transformada de Fourier (FT-IR). Foi comprovada a indução de hipometilação do DNA pelo VPA em células HeLa, semelhante ao observado em tratamentos com a 5-aza-CdR. A redução nos níveis de 5mC concomitante a um efeito de descompactação cromatínica pelo VPA nestas células persistiram por 24 h na ausência da droga, porém não por 48 h, demonstrando papel da metilação de DNA em eventos de remodelação da cromatina, com efeitos de longa duração. A demetilação observada em resposta ao VPA também influenciou os perfis espectrais do DNA no infravermelho, afetando mais significativamente os picos relacionados a vibrações de estiramento simétrico e antissimétrico do grupamento metil da 5mC. Tanto os tratamentos com VPA quanto com a 5-aza-CdR não alteraram as marcas de 5caC e 5fC mas foram capazes de aumentar os níveis de 5hmC, enquanto as enzimas estudadas (DNMT1, TET1 e TET2) apresentaram resposta diferencial a estas drogas. Foi assim reforçada a influência do VPA e da 5-aza-CdR sobre vias ativas de demetilação do DNA e demonstrado que estas drogas atuam por meio de mecanismos distintos. Em conjunto, foi possível obter maiores informações a respeito da ação do VPA sobre a metilação de DNA em células HeLa, permitindo comparações dos efeitos desta droga sobre outras linhagens tumorais agressivas. Também foi possível estabelecer um paralelo entre a ação epigenética do VPA com a de outro composto, a 5-aza-CdR, e assim ter maior conhecimento dos mecanismos de ação destas drogas amplamente utilizadasAbstract: Valproic acid (VPA) is a well-established antiepileptic drug and also an inhibitor of histone deacetylases (HDAC), leading to hyperacetylation of histones H3 and H4. Moreover, VPA has been suggested to induce DNA demethylation in several cell types, possibly through an active and replication-independent way. In the present work, the effects of VPA over the 5-methylcytosine (5mC) abundance and active DNA demethylation elements were studied in HeLa cells, compared to 5-aza-2¿-deoxycytidine (5-aza-CdR), a known DNA demethylator. In addition, the contribution of the VPA-induced DNA demethylation on the chromatin remodeling, previously attributed to HDAC inhibition, was investigated in this cell type. The effect of VPA on DNA 5mC marks was also studied analyzing DNA infrared spectral profiles. In both VPA- and 5-aza-CdR treated cells, immunocytochemistry and ELISA techniques were used to evaluate DNA methylation levels. The cytosine derivatives 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-carboxylcytosine (5caC) and 5-formylcytosine (5-fC) were investigated by immunocytochemistry. The gene expression of DNA methyltransferase 1 (DNMT1) and of enzymes of the ten-eleven translocation family (TET), TET1 and TET2 was assessed by quantitative real time PCR, and protein levels of DNMT1 and TET2 were obtained using Western blotting. Scanning microspectrophotometer assays allowed the analysis of changes in chromatin supraorganization of HeLa cells treated with VPA and spectral profiles of DNA were obtained by Fourier-transform infrared (FT-IR) microspectroscopy. Induction of DNA hypomethylation was found to be induced by both VPA and 5-aza-CdR treatments. The reduction of 5mC levels concomitant to a chromatin decondensation status induced by VPA in these cells persisted for 24 h in the absence of the drug, although not for 48 h, demonstrating a role of DNA methylation on chromatin remodeling events, with long-standing effects. The demethylation observed in response to VPA also influenced the DNA infrared spectral profiles, affecting more significantly the peaks related to symmetric and antisymmetric stretching vibrations of the methyl group from 5mC. No changes in 5caC and 5fC were observed in VPA- or 5-aza-CdR treatments, although both drugs increased 5hmC levels and differentially affected the enzymes studied here (DNMT1, TET1 and TET2). Thereby, the influence of VPA and 5-aza-CdR on active DNA demethylation pathways was reinforced and it was demonstrated that these drugs act by different mechanisms. Taken these results together, more information regarding the effects of VPA on DNA methylation in HeLa cells was obtained, allowing further comparisons between the effects of this drug on other tumor cell lines as aggressive as HeLa cells. Furthermore, a parallel was established between the epigenetic action of VPA and that of another compound, 5-aza-CdR, thus contributing with additional and new data on the mechanisms of action of these widely used drugsMestradoBiologia CelularMestra em Biologia Celular e Estrutural2014/23842-0CNPQFAPES