Increasing activity of glucohydrolases produced by Trichoderma harzianum by culture medium optimization and classic genetic improvement aiming the viability of ethanol 2G

Orientadores: Aline Carvalho da Costa, José Geraldo da Cruz PradellaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: Uma das etapas críticas no processo de produção de etanol de segunda geração a partir de bagaço de cana-de-açúcar é a produção das enzimas de forma eficiente e com baixo custo. Neste contexto, o objetivo desta tese foi estudar formas de aumentar a atividade das glicohidrolases produzidas por Trichoderma harzianum P49P11 pela otimização do meio de cultura e pelo melhoramento genético clássico, bem como desenvolver as metodologias necessárias para atingir este objetivo. Desenvolveu-se uma metodologia para otimizar meios de cultura em pequena escala, utilizando frascos agitados, sendo o pH controlado pelo tampão biftalato de potássio. Esta metodologia permitiu vários estudos que ajudaram a compreender melhor o sistema fisiológico de indução das enzimas pelos diferentes meios de cultura estudados. Também foi desenvolvida uma metodologia para medida da atividade das glicohidrolases utilizando bagaço de cana-de-açúcar como substrato de uma hidrólise realizada em mini escala a 50 ºC, sendo a liberação de açúcares redutores em 2 h de reação uma estimativa da atividade das enzimas. Para obter os mutantes utilizados ao longo do trabalho, foram realizadas cinco mutações cumulativas utilizando o reagente químico EMS. No final do processo de melhoramento genético, selecionou-se a cepa 5PCE15, que apresentou características vantajosas para o processo, tais como não produzir espuma no seu ambiente de cultivo e apresentar uma maior produção de glicohidrolases em um meio contendo 2 % de glicoseAbstract: One of the critical steps in the production of second generation ethanol from sugarcane bagasse is the production of enzymes efficiently and inexpensively. In this context, the objective of this project was to study ways to increase the activity of the glycohydrolases produced by Trichoderma harzianu P49P11 by optimization of the culture medium and by classical genetic improvement, , as well as to develop the necessary methodologies to reach this objective. A methodology was developed to optimize small-scale culture media using stirred flasks with pH controlled by potassium biftalate buffer. This methodology allowed several studies that helped to better understand the system of induction of the enzymes by the different culture media studied. It was also developed a methodology to measure the activity of glycohydrolases using sugar cane bagasse as substrate of a hydrolysis carried out in mini scale at 50ºC, and the release of reducing sugars in 2h of reaction was used as an estimate of the activity of the enzymes. In order to obtain the mutants used throughout the work, five cumulative mutations were performed using the EMS chemical reagent. At the end of the genetic improvement process, strain 5PCE15 was selected, which presented advantageous characteristics for the process, such as not producing foam in its culture environment and presenting a higher production of glycohydrolases in a medium containing 2 % glucoseDoutoradoEngenharia de ProcessosDoutor em Engenharia Química2014/21821-5FAPES