Molecular studies in focal cortical dysplasias

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes Cendes, André Schwambach Vieira e Fabio Rossi TorresTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: As displasias corticais focais (DCFs) são uma importante causa de epilepsia refratária às drogas antiepilépticas e nossos objetivos neste trabalho foram ajudar a elucidar os mecanismos moleculares envolvidos na DCF tipo II e, identificar e validar biomarcadores não invasivos para serem utilizados no diagnóstico desta malformação cortical, usando para essas duas abordagens os microRNAs. Foi utilizado o tecido cerebral de pacientes com DCF tipo II submetidos à cirurgia para controles das crises epilépticas e tecido cerebral de indivíduos controles; além de plasma sanguíneo desses mesmos pacientes e de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial, bem como de indivíduos normais. Foram utilizadas as seguintes técnicas neste trabalho: microarranjos de microRNAs, PCR quantitativa, hibridização in situ, ensaios de gene repórter e sequenciamento de nova geração. Identificamos três microRNAs, hsa-let-7f, hsa-miR-31 e hsa-miR34a, com a expressão diminuída nos tecidos do pacientes. Em contrapartida, observamos um aumento da expressão de um fator de transcrição envolvido na diferenciação neuroglial, NEUROG2. Também encontramos o gene RND2, um alvo de NEUROG2, com a expressão aumentada, e sabe-se que tem um papel fundamental na migração radial dos neurônios corticais. Experimentos in vitro mostraram que NEUROG2 é regulado na região 5¿ não traduzida por hsa-miR-34a. Além disso, foi observada uma forte expressão nuclear de NEUROG2 em células aberrantes presentes neste subtipo da DCF. Juntos, esses achados indicam que provavelmente há uma falha na regulação pós-transcricional da expressão de NEUROG2 e que isso tem uma repercussão em cadeia, levando a falhas tanto no processo de diferenciação neuroglial como de migração neuronal na DCF tipo II, o que pode explicar a presença de células aberrantes e a epileptogênese nesta malformação cortical. Outro achado importante, em nosso estudo, consistiu da identificação do hsa-miR-134 como potencial biomarcador não invasivo para ajudar no diagnóstico de pacientes com epilepsia do lobo temporal mesial. Este microRNA circulante no plasma sanguíneo é capaz de discriminar o grupo de pacientes do grupo de controles com uma área sob a curva (AUC) de 0.75, independentemente da sua resposta ao tratamento medicamentoso ou à presença de sinais de esclerose hipocampal nos achados de ressonância magnética. Com isso, por meio dos microRNAs, foi possível sugerir um mecanismo molecular envolvido na DCF tipo II, bem como identificar um microRNA circulante com potencial uso no diagnóstico de epilepsia do lobo temporalAbstract: Focal cortical dysplasias (FCDs) are an important cause of drug-resistant epilepsy and our goals were to help elucidate the molecular mechanisms involved in FCD type II and to identify and validate reliable non-invasive biomarkers to be used in diagnosis of epilepsy related with this cortical malformation, using for these two approaches microRNAs as a molecular tool. We used brain tissue from patients with FCD type II and normal controls, besides blood plasma was used from patients with FCD type II, patients with mesial temporal lobe epilepsy (MTLE), as well as controls individuals. Microarrays of microRNAs, quantitative PCR, in situ hybridization, luciferase reporter assays and exome sequencing was performed to validate and further explore our data. We identified hsa-let-7f, hsa-miR-31 and hsa-miR34a were downregulated in tissue from FCD type II, whereas a transcription factor involved in neuronal and glial fate specification, NEUROG2, was found upregulated. We also found RND2 gene, a NEUROG2-target, upregulated, which has a key role in radial migration of cortical neurons. In vitro experiments showed that hsa-miR-34a downregulates NEUROG2 by binding to its 5'-untranslated region. Moreover, we observed strong nuclear expression of NEUROG2 in aberrant cells present in FCD type II, balloon cells and dysmorphic neurons. Together, these findings indicate that a faulty coupling in neuronal differentiation and migration mechanisms may explain the presence of aberrant cells and intrinsic epileptogenesis in this cortical malformation. Another important finding, in our study, was the identification of the downregulation of hsa-miR-134 as a potential non-invasive biomarker to support the diagnosis of patients with MTLE. This circulating microRNA could be used to discriminate MTLE patients with an area under the curve (AUC) of 0.75, regardless of their response to pharmacotherapy or the presence of MRI signs of hippocampal sclerosis. Together, these findings allowed us to suggest a potential molecular mechanism involved in FCD type II, due to microRNAs, as well to identify a circulating microRNA as biomarker of epilepsyDoutoradoFisiopatologia MédicaDoutora em CiênciasCAPE