Mesenchymal stem cell epigenetic modulation after DNA methyltransferase inhibitor RG108 treatment

Orientador: Denise Carleto AndiaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Introdução: As células mesenquimais indiferenciada da medula óssea (CMIMO) são consideradas fonte promissora para terapia celular, embora sua regulação epigenética não seja totalmente compreendida. O RG108 bloqueia o sítio ativo das enzimas que metilam o DNA, as DNA-metiltransferases (DNMTs). Objetivo: Melhor compreender a biologia básica das CMIMO e efeitos do RG108 e da consequente inibição das DNMTs, nas modificações epigenéticas globalmente e em genes específicos da maquinaria epigenética. Além disso, foram avaliados genes envolvidos na manutenção do estado multipotente das CMIMO. Métodos: As células foram distribuídas em grupos e tratadas durante 3 dias: DMEM ¿ células cultivadas em meio de cultura padrão; Dimetilsulfóxido (DMSO/veículo do RG108) ¿ células cultivadas em DMEM+DMSO; RG108 ¿ células cultivadas em DMEM+RG108 (50µM) e os efeitos foram testados, avaliando-se viabilidade, tempo de duplicação e apoptose celular. A metilação/hidroximetilação global, atividade das desmetilases e das DNMTs e níveis da proteína DNMT1 foram avaliados por ensaios colorimétricos. Os níveis de transcritos dos genes DNMT1, Ten-eleven-translocation-(TET) -1 e POU5F1-POU-class-5-homeobox-1-(OCT4) foram quantificados pela reação em cadeia da polimerase (qPCR) e os níveis de metilação/hidroximetilação dos genes DNMT1, DNMT3B e NANOG-Homeobox (NANOG) foram avaliados por qPCR, precedidos pela glicosilação da 5-hidroximetilcitosina e digestão com enzimas de restrição. Resultados:O RG108 não reduz a viabilidade celular ou induz a morte celular por apoptose e não afeta a taxa de proliferação celular. Globalmente, o RG108 diminui a metilação do DNA (p ? 0,05), sem modulação dos níveis de hidroximetilação. Houve diminuição na atividade das DNMTs para os grupos DMSO e RG108, comparados ao grupo DMEM (p ? 0,05); antagonicamente, houve aumento na atividade das desmetilases para os grupos DMSO e RG108, em comparação ao DMEM (p ? 0,05), sem mudança nos níveis da proteína DNMT1. Os níveis de RNAm para o gene DNMT1 foram reduzidos para os grupos DMSO e RG108 (p ? 0,05) e o grupo tratado com RG108 apresentou níveis aumentados de RNAm para os genes TET1 (p ? 0,05) e OCT 4 (p ? 0,05), comparando-se ao DMEM. Não houve modulação nos níveis de metilação/hidroximetilação do gene DNMT1. Entretanto, um aumento nos níveis de metilação do gene DNMT3B foi observado nos grupos DMSO e RG108, comparados ao DMEM (p ? 0,05), sem modulação nos níveis de hidroximetilação. Em contrapartida, o gene NANOG respondeu diminuindo os níveis de hidroximetilação do DNA para o grupo RG108 (p ? 0,05), sem modulação nos níveis de metilação do DNA. Conclusão: O RG108 é um agente desmetilante seguro, capaz de modular a atividade das DNMTs e desmetilases, nas CMIMO. Essa modulação estimulou mudanças globais no DNA e em transcritos de genes específicos. Entretanto, não houve modulação para o gene ou a proteína DNMT1, embora tenha sido observada para o gene DNMT3B e também para o gene NANOG, modulado em seus níveis de hidroximetilação. O modulador epigenético RG108 e a consequente inibição da DNMT1 promovem mudanças nos genes da maquinaria epigenética e em genes relevantes para a manutenção das CMIMO em estado indiferenciado. Interessantemente, o DMSO também desencadeou modulação, entretanto, esta modulação foi restrita aos genes da maquinaria epigenéticaAbstract: Background: The human bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hBMMSCs) have been considered a promising source for cellular therapy, althoug their epigenetic regulation is not well understood. The RG108 is a DNA methyltransferase (DNMT) inhibitor, designed to block the active site of the DNMTs enzymes. Objective: This study was designed to better comprehend the basic biology of the hBMMSCs and the effects of the RG108 and the DNMT1 inhibition, in the epigenetic global levels and in specific genes from epigenetic machinery; in addition, core genes involved in maintaining the hBMMSCs in the undifferentiated state were also evaluated. Methods: The hBMMSCs were distributed in groups and treated during 3 days: DMEM ¿ cells were cultivated in complete culture medium; DMSO (RG108 vehicle) ¿ cells were cultivated in complete culture medium/DMSO; RG108 - cells were cultivated in complete culture medium/RG108 (50 µM) and the RG108 effect was assessed through cell viability, population doubling time and apoptosis assays. The global DNA methylation and hydroxymethylation levels, the demethylases and the DNMTs activities and the DNMT1 protein levels were assessed by colorimetric assays. The DNMT1, TET1 and OCT4 genes transcript levels were quantified by quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) and the DNMT1/3B/NANOG genes methylation/hydroxymethylation status were evaluated by qPCR, preceded by glucosylation of 5-hydroxymethylcytosine and restriction enzymes digestion. Results: The RG108 did not reduce the cell viability or induce cellular death by apoptosis and the proliferation rate in vitro was not affected. At global levels, the RG108 significantly decreased methylation status (p ? 0.05), without modulation at hydroxymethylation levels. There was a significant decrease in the DNMTs activity levels for DMSO and RG108 treated cells, comparing to the DMEM group (p ? 0.05); in an antagonistic way, the demethylases activity levels were found to be increased for the DMSO and RG108 groups, comparing to the DMEM group (p ? 0.05), without changing in the DNMT1 protein levels. The DNMT1 mRNA levels were decreased for DMSO and RG108 groups (p ? 0.05) and the RG108 treated cells showed an increase in the TET1 mRNA levels (p ? 0.05) and OCT4 mRNA levels (p ? 0.05), comparing to the DMEM group. There was no modulation in the DNMT1 gene methylation/hydroxymethylation levels; however, a significant increase in the methylation levels of DNMT3B was observed for the DMSO and RG108 groups, comparing to the DMEM group (p ? 0.05) and no modulation in the hydroxymethylation levels was found. On the other hand, the NANOG gene have responded significantly decreasing the hydroxymethylation levels for the RG108 group (p ? 0.05), without modulation in its methylation levels. Conclusions: The RG108 is a safe demethylating agent, with the ability of modulating the DNMTs and demethylases activities, in the hBMMSCs. This modulation was able to trigger changes at global status and transcription levels; however, no modulation was found at DNMT1 protein and gene levels; yet it was observed at DNMT3B gene instead, also reflecting at NANOG gene, which was modulated at hydroxymethylation levels. The epigenetic modulator RG108 and the DNMT1 inhibition are capable of promoting changes in the epigenetic machinery genes and in relevant genes for maintaining the hBMMSCs in an undifferentiated state. Interestingly, the DMSO was also capable of triggering modulation, however it was restricted to the epigenetic machinery genesMestradoPeriodontiaMestra em Clínica Odontológica2015/02160-0FAPES