Functional and structural characterization of ZapA protein, involved in bacterial cell division

Orientador: Ana Carolina de Mattos ZeriTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A proteína ZapA está envolvida na divisão celular bacteriana. Diversos elementos celulares se organizam em um determinado momento do ciclo celular com a finalidade de dividir uma única célula bacteriana em duas células filhas. Para que esta divisão ocorra, parede e envelope celular alteram sua direção para criar um septo, guiado por um complexo macromolecular denominado divisomo. A separação destas células filhas é assessorada pela constrição de uma estrutura medial, no formato de anel, por isso denominada anel Z. Este anel é formado por polímeros de FtsZ, uma homóloga de tubulina que se polimeriza na forma de protofilamentos, que por sua vez, organizam-se na forma de feixes, que se conectam em uma estrutura circular. A formação do anel Z é um evento chave, e interconecta diversas proteínas envolvidas na divisão celular. O local e o tempo em que esta divisão ocorre devem ser finamente regulados, a fim de evitar a formação de células filhas afuncionais. Ela deve ocorrer na região medial, apenas depois que todos os componentes celulares já se duplicaram e segregaram para seus respectivos polos. Dentre as proteínas que interferem neste processo, existem aquelas envolvidas na regulação/síntese de parede celular e as proteínas moduladoras do anel Z. As moduladoras estimulam ou inibem a formação do anel Z, de acordo com a necessidade espaço temporal da célula. ZapA (Z ring associated protein A) estabiliza interações laterais de protofilamentos de FtsZ, auxiliando-os na formação de uma estrutura circular continua, o anel Z. Embora a ZapA tenha sido descoberta em 2002, pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares de sua interação com FtsZ e de que forma ela estabiliza os protofilamentos. Para melhor compreender o papel da ZapA neste processo, realizamos estudos estruturais da proteína ZapA de G. stearothermophilus, nos quais resolvemos sua estrutura por RMN e realizamos modelagem molecular do complexo FtsZ-ZapA. Estudamos a natureza da interação através de técnicas como calorimetria (ITC), que nos indicou uma baixa constante de associação e através de co-purificações de FtsZ com ZapA selvagem e mutantes, auxiliando no entendimento da importância de cada um dos resíduos de aminoácido mutado em questão. Foi identificada uma possível região de interação entre estas proteínas, na qual a hélice H3 e a região N-terminal (serina 13) de FtsZ teriam um importante papel, assim como a hélice H1 de ZapA. O entendimento de todo o processo da divisão celular é de grande valia pois pode ser utilizado como base para o desenvolvimento de uma nova classe de antibióticos, capaz de impedir a divisão bacterianaAbstract: The ZapA protein is involved in bacterial cell division. Several cellular elements are organized at the right time of the cell cycle in order to divide a single bacterial cell into two daughter cells. For this division to occur, the cell wall and cell envelope create a septum, guided by a macromolecular complex called divisome. The separation of the daughter cells is assisted by the constriction of a ring-shaped structure, the Z ring. This ring is formed by FtsZ polymers, a tubulin homolog that polymerize into protofilaments, which in turn, are organized in bundles, which are connected in a circular structure. The Z ring formation is a key event, and interconnects several proteins involved in cell division. The place and the time of this division have to be finely regulated, in order to prevent the formation of nonfunctional daughter cells. It must occur in the medial region, only after all the cellular components have already doubled and segregated to their respective poles. Among the proteins that interfere in this process, there are those involved in the regulation / synthesis of cell wall and proteins that modulate the Z ring. These modulators act by stimulating or inhibiting the Z ring formation, according to the cell requirement. ZapA (Z ring associated protein A) stabilizes lateral interactions of protofilaments of FtsZ, assisting in the Z ring formation. Although ZapA was discovered in 2002, the molecular mechanisms of their interaction with FtsZ and how it stabilizes its protofilaments are not clear. To better understand the role of ZapA in this process, we conducted structural studies of ZapA protein from G. stearothermophilus, by solving its structure by NMR and performing computational molecular docking of the FtsZ-ZapA complex. We studied the nature of the interaction by techniques such as calorimetry (ITC), which indicated the low association constant, and by co-purification assays between FtsZ and ZapA (wild type and mutants), aiding in the understanding of the importance of each amino acid residue mutated. We have identified a possible interaction area between these proteins in which the helix H3 and N-terminal region (serine 13) of FtsZ have an important role as well as the H1 ZapA helix. The understanding of the whole process of cell division is of great value, and can be used as the basis for the development of a new class of antibiotics capable of preventing bacterial divisionDoutoradoBioquimicaDoutora em Biologia Funcional e Molecular2012/15123-8FAPESPCAPE