Glucose 6-phosphate dehydrogenase as molecular target for drug development : structural studies and inhibitors identification

Orientador: Artur Torres CordeiroTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Tripanossomíase americana e leishmanioses são doenças infecciosas potencialmente fatais, causadas pelos protozoários flagedos Trypanosoma cruzi e Leishmania spp, respectivamente. Essas enfermidades afetam milhões de pessoas, majoritariamente em países em desenvolvimento de regiões tropicais e subtropicais, causando um grande impacto nas populações afetadas. Os fármacos atualmente disponíveis para tratar essas condições possuem limitações quanto à segurança, eficácia e/ou regime de tratamento. Esse panorama ressalta a importância de iniciativas que contribuam para a compreensão da biologia destes parasitas ou para o desenvolvimento de novos fármacos com utilidade terapêutica. A enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PDH) tem sido explorada como um alvo promissor para o desenvolvimento de fármacos. A G6PDH catalisa o primeiro passo da via de pentose fosfato, uma via essencial para manutenção do balanço oxidativo que também supre as células com moléculas importantes para biossíntese de lipídeos, nucleotídeos, vitaminas e aminoácidos. Esta enzima é essencial para sobrevivência de protozoários do gênero Trypanosoma de modo que depleção dos níveis da proteína, ou sua inibição por moléculas orgânicas, afeta o crescimento destes parasitas. Até o momento, os melhores inibidores da G6PDH são derivados halogenados do esteroide desidroepiandrosterona (DHEA), capazes de inibir fortemente as G6PDHs de humanos (HsG6PDH) e T. cruzi (TcG6PDH), mas sem efeito sobre a enzima de L. mexicana (LmG6PDH). Novos inibidores das G6PDHs foram identificados em uma coleção de 30.000 moléculas orgânicas através de uma campanha de triagem biológica automatizada em larga escala (HTS) com a TcG6PDH. Derivados de quinazolinonas e tienopirimidinas mostraram inibir a TcG6PDH por mecanismo incompetitivo e regras preliminares de relações estrutura-atividade foram estabelecidas para ambas as classes de inibidores. Características estruturais que contribuem para seletividade para a TcG6PDH sobre a enzima humana foram identificadas e experimentos com a forma epimastigota de T. cruzi mostraram que os derivados de quinazolinonas afetam a proliferação do parasito in vitro, indicando que as essas moléculas são promissores inibidores que devem ser considerados para otimizações futuras. Derivados de quinazolinonas também se mostraram capazes de inibir a LmG6PDH por mecanismo incompetitivo, confirmando que a proteína de Leishmania possui um sítio para interação com inibidores após a formação do complexo enzima-substrato(s). Os derivados de quinazolinonas ativos contra a LmG6PDH surgem como potenciais sondas químicas para avaliar a importância destas enzimas em parasitas do gênero Leishmania. Finalmente, estudos estruturais com as G6PDHs permitiram a obtenção da estrutura cristalográfica do complexo ternário Tc?G6PDH-G6P-NADPH, que revelou detalhes das bases moleculares de reconhecimento do substrato e do cofator. A comparação desta estrutura com a enzima homologa humana permitiu a identificação de uma cavidade próxima ao sítio de ligação do cofator que pode ser explorada para o desenho de novos inibidores competitivos seletivos para a TcG6PDH. Deste modo, nossos resultados contribuem para um aumento no conhecimento estrutural e funcional sobre as G6PDHs, uma enzima com papel biológico essencial, podendo em ultima instância auxiliar para um aumento da compreensão sobre a biologia de parasitas tripanossomatídeos, bem como para o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas que venham atender necessidades clínicas não satisfeitas para doença de Chagas e leishmaniosesAbstract: American trypanosomiasis and leishmaniasis are life-threatening infectious diseases, caused by flagellate protozoans Trypanosoma cruzi e Leishmania spp, respectively. Affecting millions of individuals, mainly in developing countries of tropical and subtropical areas, those conditions have a great impact in affected populations. Currently available drugs to treat those diseases suffer from limitations related to security, efficacy or treatment regimens. This scenario highlights the relevance of initiatives that contributes to the comprehension of the parasites biology or to the development of new clinically useful drugs. The enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PDH) has been explored as a promising target for the development of new drugs. G6PDH catalysis the first and rate limiting step of the pentose phosphate pathway, which is essential for the maintenance of oxidative balance that also provides cells with important molecules for the biosynthesis of lipids, nucleotides, vitamins and amino acids. This enzyme is essential for the survival of protozoans from the genus Trypanosoma, in such a way that depletion of protein levels, or its specific inhibition by organic molecules, hampers parasites growth. Presently, the best G6PDH inhibitors are halogenated derivatives of the steroid dehydroepiandrosterone (DHEA), capable to strongly inhibit G6PDHs from humans (HsG6PDH) and T. cruzi (TcG6PDH), but with no effect on the L. mexicana enzyme (LmG6PDH). New G6PDH inibitors have been identified in a 30.000 compounds library by a high throughput screening (HTS) campaign with the TcG6PDH. Quinazolinone and thienopyrimidine derivatives showed to inhibit the TcG6PDH through an uncompetitive mechanism and preliminary structure-activity relationship were established for both inhibitor classes. Structural features that contribute for selectivity towards TcG6PDH over the human enzyme were identified and experiments with T. cruzi epimastigote form showed that quinazolinone derivatives arrest parasite growth in vitro, suggesting that those molecules are promissing inhibitors that should be considered for further optimization. Quinazolinone derivatives also showed to inhibit the LmG6PDH by uncompetitive mechanism, supporting the notion that proteins from Leishmania have an interaction site for inhibitors upon formation of an enzyme-substrate(s) complex. Quinazolinones derivatives with activity over the LmG6PDH emerge as potential chemical probes to evaluate the importance of this enzyme for parasites from the genus Leishmania. Finally, structural studies with G6PDHs allowed the obtention of the crystallographic structure from the ternary complex Tc?G6PDH-G6P-NADPH, which reveals details on the molecular basis of substrate and cofactor recognition. Comparison of this structure with the human homologous enzyme revealed a cavity on the vicinity of the cofactor-binding site that might be explored towards the design of new competitive inhibitors selective for the TcG6PDH. In this way, our results contribute to improve the structural and functional knowledge about the G6PDHs, an enzyme with an essential biological role, and may ultimately help to better understand the trypanosomatids parasite biology and to development of new therapeutic alternatives that satisfy unmet medical needs for Chagas disease and leishmaniasisDoutoradoFármacos, Medicamentos e Insumos para SaúdeDoutor em Ciências2010/17849-0, 2014/07533-7FAPES