Phytochemistry and evaluation of the photoinduced biological effect of extracts and isolated substances from Annonaceae (plant in nature and obtained by cell culture)

Orientador: Marcos José SalvadorTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O objetivo do estudo químico, biológico e biotecnológico de duas espécies de Annonaceae (Annona cacans, Annona mucosa, Annona squamosa, ou Guatteria hispida) foi buscar substâncias bioativas e fotoativadas nestas matrizes vegetais (plantas in natura e obtidas por cultura de células). O estudo dos extratos brutos metanólicos foi realizado monitorando o espectro de absorção na região de interesse em terapia fotodinâmica (600 a 800 nm), na análise do espectro de fluorescência (modo emissão e excitação), na avaliação da eficiência fotoquímica e nos resultados dos bioensaios, incluindo a avaliação do efeito biológico fotoinduzido por radiação laser a 660 nm em modelo experimental in vitro de terapia fotodinâmica antimicrobiana (PDT-antimicrobiana). Para tanto, procedeu-se a adequação de metodologia para os ensaios biologicos em PDT-antimicrobiana e o desenvolvimento de procedimentos analíticos, incluindo o estudo fitoquímico biomonitorado, obtendo-se inicialmente o perfil químico (CCDC, CG, CLAE, RMN ou ESI-MS). Os resultados possibilitaram a identificação de 11 alcalóides já descritos em literatura para espécies de Annonaceae diretamente nos extratos brutos (desreplicação). Após a etapa de triagem e por comparação entre os resultados obtidos foi possível definir a G. hispida e A. squamosa como as espécies mais promissoras para as quais continuou-se o estudo. As demais espécies apresentaram baixa absorção e fluorescência na região de interesse em PDT e baixa eficiência fotoquímica. Os extratos das duas espécies escolhedas com substâncias que não puderam ser identificadas na etapa de desreplicação foram submetidos ao fracionamento biomonitorado e para as substâncias isoladas e purificadas realizou-se a sua determinação estrutural utilizando-se métodos espectroscópicos de análise o que possibilitou a identificação de 5 alcalóides: os alcalóide Isomoschatolina e 9-metoxi-isomoschatolina foram isolados apenas das amostras de G. hispida e o alcalóide Palmatina isolado apenas do extrato de A. squamosa, enquanto os alcalóides Anonaina e Liriodenina foram isolados dos extratos das duas espécies. No estudo biotecnológico procedeu-se o estabelecimento e desenvolvimento de culturas de células das duas espécies vegetais mais promissoras nos bioensaios, visando, além do estudo fitoquímico, a manipulação de fatores físicos e químicos para a produção de metabólitos secundários e o estudo comparativo dos metabólitos bioativos nas culturas de células e aqueles obtidos de partes da planta in natura. Foram obtidos calos friáveis e livres de oxidação para as duas espécies. O estudo comparativo dos espectros de ESI-MS/MS dos extratos bioativos mostrou similaridades entre a composição dos extratos da planta in natura com o obtido por cultura de células e possibilitou a quantificação por UHPLC-MS de alguns alcalóides já descritos para espécies de Annonaceae nas amostras estudadas, incluindo os alcalóides asimilobina, Liriodenina, lisicamina e Palmatina que apresentam potencial para aplicação em PDT antimicrobiana observando-se similaridades nos resultados em termos químicos e biológicos. Em colaboração com o "Laboratoire Jean Perrin, Campus Jussieu, Université Pierre et Marie Curie, em Paris, França", foram realizados alguns estudos dos alcalóides isoquinolínicos, tais como, Isomoschatolina (Gh1) e Palmatina (As3) sozinhos e associados à ciclodextrina. Os estudos sugerem que esses alcalóides quando complexados são melhor direcionados no interior das células tumorais e se concentram predominantemente nos lisossomosAbstract: he aim of the study chemical, biological and biotechnological of two Annonaceae¿s species (Annona Cacans, Annona mucosa, Annona squamosa or Guatteria hispida) went for bioactive substances and photoactivated these plant matrices (plants in nature and obtained by cell culture). The study of methanolic crude extract was carried out by monitoring the absorption spectrum in the region of interest in photodynamic therapy (600 to 800 nm), the fluorescence spectrum analysis (mode emission and excitation), the evaluation of the photochemical efficiency and the results of bioassays including assessment of the biological effect photoinduced by laser radiation at 660 nm in an experimental model in vitro antimicrobial photodynamic therapy (PDT-antimicrobial). Therefore, we proceeded to fit methodology for biological testing PDT-antimicrobial and development of analytical procedures including the study bioactivity Phytochemistry, obtaining initially a chemical profile (CCDC, GC, HPLC, NMR and ESI-MS ). The results allowed the identification of 11 alkaloids already described in literature for Annonaceae species directly in crude extracts (dereplication). After the step of screening and by comparing the results obtained it was possible to define G hispida and. A. squamosa as the most promising species for which continued the study. The other species showed low absorption and fluorescence in the region of interest in PDT and low photochemical efficiency. The extracts of the two select species with substances that could not be identified in dereplication stage underwent biomonitored fractionation and isolated substances and purified held its structural determination using spectroscopic methods of analysis which enabled the identification of 5 alkaloids: alkaloid Isomoschatoline and 9-methoxy-isomoschatoline were isolated only from samples G. hispida and Palmatine alkaloid isolated only from A. squamosa extract while Anonaina and liriodenine alkaloids have been isolated from two species of the extracts. In biotechnology study proceeded to the establishment and development of cell cultures of the two most promising species in bioassays, aimed beyond the phytochemical study, the handling of physical and chemical factors for the production of secondary metabolites and the comparative study of bioactive metabolites in cell cultures and those obtained from the fresh plant parts. Friable callus and oxidation free were obtained for the two species. The comparative analysis of ESI-MS / MS spectra of the bioactive extracts showed similarities between the composition of the plant extracts in nature to that obtained by cultivating cells and allowed the quantitation UHPLC-MS some alkaloids already described for species of Annonaceae in samples studied, including Asimilobine alkaloids, Liriodenine, Lysicamine and Palmatine that have potential for use in antimicrobial PDT observing similarities in results in chemical and biological terms. In collaboration with the "Laboratoire Jean Perrin, Campus Jussieu, Université Pierre et Marie Curie in Paris, France," were carried out some studies of isoquinoline alkaloids, such as Isomoschatoline (GH1) and Palmatine (AS3) alone and associated with the cyclodextrin. Studies suggest that these alkaloids are best directed when complexed within tumor cells and predominantly concentrated in the lysosomesDoutoradoBiologia VegetalDoutora em Biologia Vegetal2011/18315-2FAPES