Effects of metformin treatment on Walker-256 tumor and muscle protein metabolism in tumor-bearing Wistar rats

Orientador: Maria Cristina Cintra Gomes MarcondesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O desenvolvimento de câncer muitas vezes está associado ao desenvolvimento do quadro de caquexia. A caquexia caracteriza-se por acentuada perda de peso do hospedeiro, tanto de massa magra quanto de massa gorda. Embora a caquexia seja uma doença multifatorial, a resposta do hospedeiro ao desenvolvimento tumoral, fatores secretados pelo tumor e fatores humorais desempenham funções essenciais no estabelecimento desse quadro. Dentre os fatores secretados há o fator indutor de proteólise, que é uma glicoproteína responsável por aumentar a degradação de proteínas no músculo esquelético. Aventa-se que a metformina, um hipoglicemiante oral, apresenta potencial contra o desenvolvimento de tumores, pois ativa a AMPK que inibe mTOR, que é uma proteína chave em vias que controlam a síntese de proteínas. Para testar essa hipótese, avaliou-se o efeito do tratamento com metformina sobre o desenvolvimento do tumor, utilizando como modelo o tumor de Walker 256, tanto in vivo quanto in vitro, e sobre o metabolismo proteico do músculo gastrocnêmio de ratos Wistar. Os animais foram distribuídos em quatro grupos: C - controle; W - portadores do tumor de Walker 256; M - tratados, por gavagem, com metformina 500 mg/Kg de peso/dia; WM - portadores do tumor de Walker 256 e tratados com metformina 500 mg/Kg de peso/dia. O tratamento com metformina reduziu a proliferação de células tumorais, tanto in vivo quanto in vitro; o peso relativo do tumor foi 38% menor em WM comparado ao W, assim como a redução do número de células positivamente marcadas com Ki-67 foi 80%. A proliferação celular e o número de colônias formadas foram 72% e 86% menores, respectivamente, em relação ao grupo sem tratamento, após 72 h. A metformina estimulou o processo de morte das células tumorais, aumentando a expressão e atividade de proteínas pró-apoptóticas, como caspase 3, e inibindo as anti-apoptóticas. No tecido tumoral, o tratamento com metformina causou aumento de 50% de p-AMPK com consequente inibição de p-mTOR e também de p-FoxO3a, comparado aos valores do grupo W. Com relação as células em cultura, também observou-se aumento de p-AMPK e inibição da fosforilação tanto de mTOR quanto de FoxO3a após 48 h de tratamento com metformina. Avaliando-se o músculo, observou-se que a metformina também modulou proteínas chaves do processo de síntese e degradação, que são afetadas pela evolução tumoral. A expressão de p-AMPK foi diminuída 60% no WM, enquanto que p-mTOR foi reduzida 30% em W. A expressão de p-FoxO3a foi 50% menor em W, enquanto que no grupo WM foi igual ao C. Já a expressão de MuRF-1 e atrogina aumentaram 100% no W, enquanto que em WM não houve alteração comparado ao C. Dessa forma, nossos dados demostraram que o tratamento com metformina inibiu o crescimento tumoral e, como consequência, diminuiu o impacto da presença do tumor sobre o metabolismo proteico do músculo esquelético. O tratamento com metformina mostra-se promissor para melhor entender o processo de caquexia bem como possível tratamento adjuvante no combate ao câncerAbstract: Cancer is often associated with cachexia. Cachexia is characterised by involuntary host weight loss, lean as well as fat mass. Although cachexia is a multifactorial disease, host response due to tumor growth, factors released by tumor and humoral factors play an essential role to induce this state. The proteolysis-inducing factor is a glycoprotein released by some tumors, and it is responsible for increasing the muscle proteins breakdown. It is known that metformin, an oral hypoglycemic, shows a potential use against tumour growth once it activates AMPK, which inhibits the mTOR activity. mTOR is a protein that has a pivotal position protein synthesis via. To address this question, we analysed metformin effects on Walker 256 tumor growth both in vivo and in vitro, and its impact on muscle protein metabolism in Wistar rats. The animals were allocated into four groups: C - control; W - Walker 256 tumor-bearing; M - treated by gavage with 500 mg/Kg of metformin a day; WM - Walker 256 tumor-bearing and treated with 500 mg/Kg of metformin a day. Metformin treatment decreased tumor cells growth both in vivo and in vitro; relative tumor weight was 38% lower in WM than in W, as well as the number of positive Ki-67 cells (80% less). The metformin treatment reduced approximately 72% of tumor cell proliferation after 72 h, while the number of colonies decreased around 86% compared to non-treated cells. Metformin promoted apoptosis in tumor cells upregulating expression and activity of proapoptotic proteins, such as caspase 3, while downregulated the expression of antiapoptotic ones. In tumor tissue, metformin treatment increased 50% of p-AMPK and inhibited mTOR and p-FoxO3a compared to W. In the same fashion, metformin increased p-AMPK and decreased phosphorylation of both mTOR and FoxO3a in cultured cells after 48 h. In skeletal muscle, metformin modulated key proteins in both protein synthesis and degradation pathways. AMPK phosphorylation decreased around 60% in WM while p-mTOR reduced by 30% in W. The p-FoxO3a expression was 50% decreased in W while there was no difference in WM compared to C. MuRF-1 and atrogin expression increased by 100% in W compared to C, while WM showed no difference compared to C. Our results demonstrated that metformin treatment inhibited tumor growth and consequently inhibiting the tumor impairment on muscle protein metabolism in the host. Therefore, metformin treatment could be a promising tool to better understanding the cachexia process as well as a possible adjuvant in treatment against cancerDoutoradoFisiologiaDoutor em Biologia Funcional e MolecularCAPE