Green propolis : characterization, antimicrobial potential and the effects in Enterococcus spp biofilms

Orientador: Arnaldo Yoshiteru KuayeTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar a possível aplicação do extrato etanólico de própolis verde e seu concentrado contra micro-organismos patogênicos assim como sua capacidade de inibição, remoção e/ou controle de biofilmes de E. faecium e E. faecalis. A própolis foi coletada de um apiário do município de Capão Bonito - SP. Os extratos etanólicos de própolis verde (EEP) foram obtidos por maceração da própolis em etanol (80%) a 70ºC por 30 minutos e submetido a concentração em evaporador rotativo (50ºC) até a remoção completa do etanol para obtenção do extrato concentrado (ECP). Identificaram-se como compostos fenólicos majoritários no EEP o artepelin C, bacarina e rutina e no ECP a rutina, pinocembrina e artepelin C. Embora a maior parte dos compostos fenólicos foram concentrados no ECP, reduziu-se os teores de galangina, artepelin C e bacarina. Os ensaios de atividade antimicrobiana indicaram a inibição de B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes e E. faecalis, no entanto observou-se resistência de Escherichia coli O157:H7, Cronobacter spp. Salmonella Enteritidis. O EEP apresentou melhor eficiência na inibição de 5 cepas de E. faecium e 5 cepas de E. faecalis que possuíam algum perfil de virulência e/ou resistência a antibióticos. Em todas essas cepas foi detectado o gene luxS. No entanto, a avaliação da capacidade de adesão por cristal violeta (CV), revelou que somente as cepas E. faecium C1E105 e E. faecalis F68 apresentaram adesão a 37ºC por 6, 12, 24 e 48 horas. Estas cepas foram mais resistentes ao EEP (CMI = 2,5 mg.mL-1) e diferenciavam-se das demais (CMI = 0,63 mg.mL-1) por possuírem algum gene de resistência à vancomicina. Os efeitos dos tratamentos com EEP ou ECP mostrou que, à 37ºC por 24 horas, ocorreu inibição da capacidade de adesão das duas cepas com 0,63 mg.mL-1 de EEP e 10,0 mg.mL-1. A avaliação da capacidade de adesão por microscopia confocal a laser (37ºC/ 24 horas) revelou que os tratamentos com ECP em concentrações < 2,5 mg.mL-1 acarretaram num aumento da densidade de células vivas e mortas, quando comparados com o biofilme controle. Nos ensaios visando a remoção de biofilmes em superfície de aço inoxidável, o EEP removeu sozinho os biofilmes de Enterococcus formados em 24 horas (a 25 e 37ºC). No entanto, foi menos eficiente que o iodo e o hipoclorito de sódio. A associação do EEP com o detergente tensoativo aniônico promoveu a remoção completa dos biofilmes de Enterococcus formados a 25ºC/ 7 dias e de Enterococcus + S. aureus formados a 25ºC/ 24 horas. No entanto, para os biofilmes de Enterococcus formados a 37ºC/ 7 dias esses agentes não foram eficientes. O tensoativo não iônico tween 80, reduziu significativamente (p < 0,05) a eficiência do EEP na remoção dos biofilmes de Enterococcus. Os resultados apresentados neste estudo mostraram o potencial de aplicação do EEP na prevenção de infecções ocasionadas por E. faecium e E. faecalis potencialmente patogênicos e resistentes à vancomicina. Mas estudos adicionais devem ser realizados para verificar seu potencial de aplicação como solução sanitizanteAbstract: The aim of this study was to evaluate the application of green propolis ethanol extract and the concentrated extract against pathogenic microorganisms, and their potential of inhibition and/ or biofilm control of E. faecium e E. faecalis. The propolis was collected from an apiary in Capão Bonito, São Paulo state. Green propolis ethanol extract (EEP) was obtained by propolis maceration in ethanol (80%) at 70ºC for 30 minutes. The EEP was concentrated in rotary evaporator (50ºC) until the ethanol removal to obtain the concentrated extrac (ECP). The prevalent phenolic compounds were: Artepillin C, bacarin and rutin EEP, and rutin, pinocembrin and artepillin C in the ECP. The majority of phenolic compounds were concentrated in ECP although galangin, artepillin C and bacarin levels were reduced. The EEP and ECP had antimicrobial activity against B. cereus, S. aureus, L. monocytogenes e E. faecalis. However, Escherichia coli O157:H7, Cronobacter spp. Salmonella Enteritidis were resistance to this estracts. The EEP showed better efficiency in the inhibition of 5 E. faecium strains and 5 E. faecalis strains (that had a virulence or antibiotic resistance). The luxS gene was detected in all Enterococcus spp strains. However, the crystal violet biofilm analysis revealed that only the strains E. faecium C1E105 e E. faecalis F68 had adhesion at 37ºC for 6, 12, 24 e 48 h. This strains showed high resistance to EEP (MIC = 2.5 mg.mL-1) and are different to other Enterococcus strains because of the vancomycin resistance profile. The EEP (0.63 mg.mL-1) and ECP (10.0 mg.mL-1) inhibited the adhesion capacity of these strains. The biofilm laser confocal microscopy evaluation revealed that the treatments with ECP in < 2.5 mg.mL-1 results in an increase of the Biovolume of live and dead cells, comparing to the control biofilm. In the experiments that aim the biofilm removal in stainless steel surfaces, the EEP removal alone de Enterococcus spp biofilm (formed at 25ºC and 37ºC after 1 day). However it was lowest efficient than iodine and sodium hypochlorite. The association of EEP and anionic surfactant promoted the removal the Enteroccus biofilm (formed at 25ºC/ 7 days) and the Enterococcus + S. aureus biofilm (formed at 25ºC/ 1 day). However, no efficiency of EEP was detected in the Enterococcus biofilm formed at 37ºC/ 7 days. The tween 80 (nonionic surfactant), reduced significantly the efficiency of EEP in the Enterococcus biofilm removal. The results of this study showed the potential of the EEP application to prevent the infections of E. faecium e E. faecalis potentially pathogenic and vancomycin resistant. Additional studies have to be conduced to the application of EEP as disinfectantDoutoradoTecnologia de AlimentosDoutora em Tecnologia de Alimentos141346/2011-6CNPQCAPE