Role of phospholipases A2 to in vitro neuromuscular and myotoxic activities of Bothrops fonsecai venom

Orientador: Léa Rodrigues SimioniDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Neste trabalho, investigou-se a participação da atividade PLA2 nas ações do veneno de B. fonsecai sobre preparações neuromusculares in vitro: extensor digitorum longus de camundongo (EDL), nervo frênico-diafragma de camundongo (NFD) e biventer cervicis de pintainho (BCp). A atividade PLA2 do veneno total foi inibida usando-se diferentes métodos como: diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio da solução nutritiva e modificação química das PLA2 com bromofenacil brometo (p-BPB). A partir do veneno total, uma fração PLA2 foi isolada e suas atividades neuromusculares e miotóxica caracterizadas. Observou-se que o veneno de B. fonsecai (100 ?/ml) é provido de ações miotóxica (24,5 ± 1,86 % de lesão celular) e bloqueadora da junção neuromuscular de preparações EDL (bloqueio total em 100 minutos de incubação). A medida da atividade fosfolipásica mostrou diferentes graus de inibição (5,26 ± 0,08 nmol HCl, 1,27 ± 0,36 nmol HCl e inibição total para diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio e modificação química, respectivamente) quando comparada à atividade do veneno total em condições normais (8,50 ± 0,51 nmol HCl). O veneno apresentou ainda atividades proteolítica (109,71 ± 5,87 UP/?g) e amidolítica (4238,00 ± 137,48 nmol/min), que foram reduzidas pela diminuição da temperatura (46,69 ± 1,51 UP/?g e 3112,26 ± 31,04 nmol/min), mas não sofreram inibição após a substituição de cálcio por estrôncio (214,61 ± 1,44 UP/?g e 3927,73 ± 31,04 nmol/min). A modificação química inibiu significativamente as atividades proteolítica (6,90 ± 7,01 UP/?g) e amidolítica (381,33 ± 49,78 nmol/min). Observou-se uma correlação positiva entre a inibição da atividade PLA2 e o grau de lesão celular (20,59 ± 1,61, 9,86 ± 0,76 e 3,75 ± 0,54 % de células lesadas após a diminuição da temperatura, a substituição de cálcio por estrôncio e modificação química, respectivamente), porém houve menor redução no bloqueio neuromuscular (46,43 ± 6,98, 68,33 ± 7,40 e 11,32 ± 5,67 % em 100 minutos de incubação após a diminuição da temperatura, substituição de cálcio por estrôncio e a modificação química, respectivamente). A fração PLA2 isolada apresentou características típicas das PLA2 Asp49, ou seja, cataliticamente ativas. Em preparações EDL (30 ?g/ml) causou bloqueio neuromuscular (33,4± 4,1 % após 120 minutos de incubação) e miotoxicidade (27,6 ± 1,6 % de células lesadas). O bloqueio neuromuscular foi menor em preparações BCp (8,2 ± 1,7 %), mas maior em NFD (55,8 ± 5,6 %), sem apresentar variação significativa na resposta miotóxica (20,16 ± 2,69 e 20,33 ± 2,37 % em NFD e BCp, respectivamente). Em preparações NFD sob estimulação direta, o bloqueio neuromuscular foi praticamente ausente (14,8 ± 3,5). A diminuição da temperatura e a substituição de cálcio por estrôncio reduziram a miotoxicidade (11,00 ± 0,90 e 1,33 ± 0,88 %, respectivamente) e aboliu o bloqueio neuromuscular nesta preparação. Concluiu-se que a miotoxicidade não está diretamente relacionada ao bloqueio neuromuscular do veneno de B. fonsecai. A atividade PLA2 parece desempenhar importante papel na lesão tecidual, mas pouco comprometimento na transmissão neuromuscular. Outras classes de proteínas ou PLA2 Lys49 parecem responsáveis pelo bloqueio neuromuscular produzido pelo venenoAbstract: In this work, we investigated the involvement of PLA2 activity to in vitro neuromuscular actions of B. fonsecai venom on mouse extensor digitorum longus (EDL), mouse phrenic nerve-diaphragm (PND) and chick biventer cervicis (BC). The venom PLA2 activity was inhibited using different methods, such as reduction of temperature, substitution of calcium by strontium in the nutritive solution and chemical modification of PLA2 with bromophenacyl bromide (p-BPB). A PLA2 fraction was isolated and its neuromuscular and myotoxic activities were characterized. It was observed that the venom of B. fonsecai (100 ?g/ml) is provided of myotoxic (24.5 ± 1.86% of cell damage) and neuromuscular blocking actions in EDL (total block after 100 minutes of incubation). The measurement of phospholipase activity showed varying degrees of inhibition (5.26 ± 0.08 nmol HCl, 1.27 ± 0.36 nmol HCl and complete inhibition in lower temperature, calcium substitution and chemical modification, respectively) when compared to the venom under normal conditions (8.50 ± 0.51 nmol HCl). The venom still showed proteolytic activity (109.71 ± 5.87 PU/ug) and amidolytic (4238.00 ± 137.48 nmol/min), which were reduced by the decrease of temperature (46.69 ± 1.51 PU/ug and 3112.26 ± 31.04 nmol/min), but suffered no inhibition after calcium replacement by strontium (214.61 ± 1.44 PU/ug and 3927.73 ± 31.04 nmol/min). The chemical modification significantly inhibited the proteolytic (6.90 ± 7.01 PU/ug) and amidolytic activity (381.33 ± 49.78 nmol/min). There was a positive correlation between inhibition of PLA2 activity and the degree of cell damage (20.59 ± 1.61, 9.86 ± 0.76 and 3.75 ± 0.54% of injured cells after lowering the temperature, replacement of calcium and strontium chemical modification, respectively), but there was less reduction in neuromuscular blockade (46.43 ± 6.98, 68.33 ± 7.40 and 11.32 ± 5.67% in 100 minutes of incubation after lowering the temperature, calcium substitution and chemical modification, respectively). The isolated PLA2 fraction had typical characteristics of PLA2 Asp49 (catalytically active). In EDL preparations (30 ?g/ml) caused neuromuscular blockade (33.4 ± 4.1% after 120 minutes of incubation) and myotoxicity (27.6 ± 1.6% of injured cells). Neuromuscular blockade was lower in BC preparations (8.2 ± 1.7%), but higher in NFD (55.8 ± 5.6%). No significant change in myotoxicity was observed between the two preparations (20.16 ± 2.69 and 20.33 ± 2.37% in PND and BC, respectively). In PND under direct stimulation the neuromuscular blockade was virtually absent (14.8 ± 3.5%). Both decrease of the temperature and calcium substitution reduced the myotoxicity (11.00 ± 0.90 and 1.33 ± 0.88%, respectively), with abolition of neuromuscular blockade. It was concluded that the myotoxicity is not directly related to the neuromuscular blockade produced by B. fonsecai venom. The PLA2 activity seems to play an important role in tissue damage, but little impairment in neuromuscular transmission. Other classes of proteins or even Lys49 PLA2 seems to be responsible for the neuromuscular blockadeMestradoFarmacologiaMestre em Farmacologia158602/2013-7CNP