Peripheral nerve regeneration after sciatic nerve tubulization and use of carbon nanoparticles and fibroblast growth factor (FGF-2)

Orientadores: Alexandre Leite Rodrigues de Oliveira, Helder José CeragioliDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Lesões nervosas periféricas, onde ocorre neurotomia, necessitam de intervenção cirúrgica visando a união dos cotos. Contudo, comumente a neurorrafia término-terminal não é possível, havendo a necessidade do uso de autoenxertos. Nesse sentido, estratégias alternativas têm sido propostas com o intuito de evitar-se o uso de enxertos autólogos. Dentre elas, a tubulização oferece inúmeras vantagens, como a orientação do crescimento das fibras, o fato de minimizar a formação de neuromas e a possibilidade do espaço entre os cotos poder ser preenchido por moléculas potencialmente capazes de aumentar a eficiência do processo regenerativo. As nanoestruturas de carbono, como os nanotubos de carbono e o grafeno, possuem muitas características que os tornam excelentes dispositivos biocompatíveis para implantes neurais. Além das nanopartículas, os fatores neurotróficos são importantes moléculas indutoras de regeneração. Entre eles, o fator de crescimento fibroblástico (FGF-2) tem mostrado importantes efeitos no sistema nervoso, promovendo desenvolvimento de neuritos, neovascularização e sobrevivência neuronal. Assim, a proposta deste trabalho foi utilizar a técnica de tubulização para regeneração de nervos periféricos, avaliando-se a eficácia de nanopartículas de carbono, bem como a eficiência do FGF-2 no interior de próteses tubulares de polietileno. Para tanto, foram utilizados 70 camundongos machos adultos pertencentes à linhagem C57BL/6J. Os animais foram divididos em sete grupos: (1) próteses tubulares de polietileno vazias (n=10); (2) próteses tubulares de polietileno com adição de nanotubos de carbono em solução salina (1mg/Kg, n=10); (3) próteses tubulares de polietileno com adição de grafeno em solução salina (1mg/Kg, n=10); (4) próteses tubulares de polietileno com adição de FGF-2 (10?g/?l, n=10); (5) próteses tubulares de polietileno com adição de FGF-2 (10?g/?l) + nanotubos de carbono em solução salina (1mg/Kg, n=10); (6) próteses tubulares de polietileno com adição de FGF-2 (10?g/?l) + grafeno em solução salina (1mg/Kg, n=10) e (7) próteses tubulares de polietileno com adição de FGF-2 (1?g/?l, n=10). Foram eutanasiados 5 animais de cada grupo, 4 e 8 semanas pós-operatórias. Os animais com 4 semanas de sobrevida foram submetidos à análise de imunoistoquímica para estudar a expressão de proteínas relacionadas ao processo regenerativo axonal. Já os animais com 8 semanas pós-operatórias, tiveram o nervo isquiático regenerado dissecado e processado para contagem dos axônios mielínicos e para análise de parâmetros histomorfométricos. A recuperação motora de todos os animais foi avaliada pelo "walking track test" (Catwalk). Os resultados indicaram que todos os materiais utilizados para preencher as próteses tubulares mostraram-se biocompatíveis. As imunomarcações se mostraram quantitativamente equivalentes entre os grupos experimentais e evidenciaram organização apropriada do nervo regenerado no interior das próteses tubulares. Nas análises histomorfométricas e funcionais não foram observadas diferenças entre os grupos, porém as fibras analisadas apresentaram sinais típicos de processo regenerativo ativo. Desta forma, concluímos que as nanopartículas empregadas no presente estudo, bem como o FGF-2, nas condições experimentais e concentrações utilizadas, não foram eficazes em amplificar o processo regenerativo. Não obstante, é possível que a funcionalização das nanoestruturas ora empregadas possa gerar resultados positivos futuros, capazes de possibilitar o reparo de nervos periféricos sem o uso de autoenxertosAbstract: Peripheral neurotomy requires surgical intervention in order to restore the contact between the stumps. However, the end-to-end neurorrhaphy is usually not possible, requiring the use of autografts. Accordingly, alternative strategies have been proposed with the aim of avoiding the use of autologous grafts. Among them, the tubulization technique provides numerous advantages, such as orientated growth of the fibers, decreased formation of neuromas and the possibility of filling the gap between the stumps with molecules that are potentially able to increase the efficiency of the regeneration process. The carbon nanostructures such as carbon nanotubes and graphene, have many characteristics that make them excellent biocompatible devices to neural implants. In addition to the nanoparticles, neurotrophic factors are important molecules for inducing regeneration. Among them, the fibroblast growth factor (FGF-2) has shown significant effects on the nervous system, promoting neurite outgrowth, neuronal survival and neovascularization. Thus, the aim of this work was to use the tubulization technique for peripheral nerve regeneration, evaluating the effectiveness of carbon nanoparticles, as well as the efficiency of FGF-2 inside polyethylene tubular prosthesis. For this, we used 70 young adult C57BL/6J male mice. These animals were divided into seven groups: (1) empty polyethylene tubular prosthesis (n=10); (2) polyethylene tubular prosthesis filled with carbon nanotubes in saline solution (1mg/kg, n=10); (3) polyethylene tubular prosthesis filled with graphene in saline solution (1mg/kg, n=10); (4) polyethylene tubular prosthesis filled with FGF-2 (10?g/?l, n=10); (5) polyethylene tubular prosthesis filled with FGF-2 (10?g/?l) + carbon nanotubes in saline solution (1mg/kg, n=10); (6) polyethylene tubular prosthesis filled with FGF-2 (10?g/?l) + graphene in saline solution (1mg/kg, n=10) and (7) polyethylene tubular prosthesis filled with FGF-2 (1?g/?l, n=10). Five animals from each group were euthanized, 4 and 8 postoperative weeks. The animals with 4 weeks after injury were submitted to immunohistochemical analysis to study the expression of proteins related to axonal regeneration process. The animals with 8 weeks postoperative had the regenerated sciatic nerve dissected out and processed for counting of myelinated axons and for morphometry evaluation. The motor recovery of all animals was evaluated by the "walking track test" (Catwalk). The results indicated that all materials used to fill the tubular prostheses are biocompatible. The immunostaining showed that all experimental groups were quantitatively similar, and showed appropriate organization of the regenerated nerve in the tubular prosthesis. The histomorphometric and functional analyzes revealed no differences between the groups, although fibers showed typical signs of active regenerative process. Thereby, we conclude that the nanoparticles used in the present study, as well as FGF-2, under the experimental conditions and the concentrations used, were not effective in amplifying the regenerative process. Nevertheless, it is possible that the functionalization of the nanostructures used herein can generate future positive results, capable of enabling repair of peripheral nerves without the use of autograftsMestradoBiologia CelularMestra em Biologia Celular e Estrutural148276/2013-0CNP