Structural and functional characterization of molecular chaperones Structural and functional characterization of molecular chaperones

Orientador: Carlos Henrique Inácio RamosTese (doutorado) ¿ Universidade Estadual de Campinas, Instituto de QuímicaResumo: As chaperonas moleculares constituem uma família de proteínas que auxiliam na formação da estrutura nativa de polipeptídeos clientes e são capazes de prevenir o enovelamento incorreto e a agregação, sendo, portanto, essenciais na manutenção da homeostase proteica. As chaperonas da família `small heat shock proteins¿ (sHsps) são expressas em diversos organismos, como bactérias, fungos, vegetais e animais, principalmente em condições de estresse térmico, contribuindo para termotolerância ao proteger proteínas da agregação. Nas plantas, as sHSPs estão presentes em todos os compartimentos celulares, o que demonstra sua importância para a célula. Devido a grande relevância biotecnológica da cana-de-açúcar caracterizamos estrutural e funcionalmente duas sHSPs desta planta: a SsHSP21.5-mt de mitocôndria e a SsHSP22.3-cp de cloroplasto. Os genes dessas proteínas foram expressos em Escherichia coli e as proteínas recombinantes foram isoladas e purificadas, em apenas duas etapas cromatográficas, com alto teor de pureza (>95%) e em um único estado oligomérico. A análise de dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência mostraram que ambas foram purificadas enoveladas, com estrutura secundária predominante do tipo folha-?. A caracterização hidrodinâmica determinou a massa molecular, coeficiente de difusão e o raio de Stokes das proteínas em solução, revelando que ambas formam grandes oligômeros globulares em solução. No entanto, a atividade chaperona não foi equivalente entre elas, pois SsHSP22.3-cp foi mais eficiente em proteger todos os substratos modelos testados (malato desidrogenase, citrato sintase, insulina, lisozima e extrato de E. coli) quando comparada com a SsHSP21.5-mt. Estes resultados mostram que as duas sHSP estudadas neste trabalho são estruturalmente semelhantes, mas diferem na atividade chaperona testada, provavelmente devido à baixa similaridade no domínios N-terminal, responsável pela função das sHSP. Estes resultados corroboram a importância da grande diversidade de genes de chaperonas desta família em plantas para manter a homeostase proteicaAbstract: Molecular chaperones belong to a family of proteins that are essential to maintain homeostasis since they are able to assist the formation of native structure of polypeptides and also to prevent incorrect folding and aggregation. The chaperones of the family `small heat shock proteins¿ (sHSPs) are expressed in several organisms such as bacteria, fungi, plants and animals, significantly under conditions of thermal stress, contributing to thermotolerance while protecting from aggregation. In plants, sHSPs are present in all cellular compartments, highlighting its importance. Due to the biotechnological relevance of sugarcane, we took to characterize structurally and functionally two os its sHSPs: the SsHSP21.5-mt from mitochondria and the SsHSP22.3-cp from chloroplast. The genes of these proteins were expressed in Escherichia coli and the recombinant proteins were isolated and purified, by two chromatographic steps, with high purity (> 95%) and in a single oligomeric state. Circular dichroism and fluorescence spectroscopy analyses showed that both proteins were folded, presenting predominantly ?-sheet secondary structure. The hydrodynamic characterization determined the molecular weight, the diffusion coefficient and the Stokes radius of the proteins in solution, revealing that both chaperones form similar large oligomers in solution with spherical shapes. However, the chaperone activity was not equivalent, since SsHSP22.3-cp was most effective in protecting all substrate models (malate dehydrogenase, citrate synthase, insulin, lysozyme and extract of E. coli) when compared to SsHSP21. 5-mt. These results showed that the two sHSPs were structurally similar, but had distinct chaperone activity, probably due to the low identity among the N-terminal domains, which are known to be involved with substrate affinity. These results confirm the importance of having great diversity of sHSP chaperones in plants for homeostasis maintenanceDoutoradoQuimica OrganicaDoutora em Ciências2011 / 05115-5FAPES