Regulation of protein phosphatases involved in cancer : structural studies of TIPRL and its interaction with protein phosphatase 2A

Orientadores: Ricardo Aparicio, Juliana Helena Costa SmetanaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O câncer é um conjunto de doenças de proliferação celular descontrolada cuja incidência na população mundial cresce continuamente ano após ano, atingindo índices alarmantes. A origem dos diversos tipos de câncer está em alterações genéticas e metabólicas das células, dentre as quais se destacam as alterações na sinalização celular mediada pela fosforilação reversível de proteínas, um processo altamente regulado por proteínas quinases e fosfatases. Neste trabalho, foram estudadas as fosfatases humanas PP2A e PTP1B. A proteína tirosina fosfatase PTP1B é superexpressa em tumores e está envolvida no câncer e em outras doenças como resistência a insulina e diabetes tipo 2, sendo considerada um bom alvo para o desenvolvimento de novas drogas. Nessa direção, foram analisadas várias séries de pequenas moléculas quanto à capacidade inibitória, tendo sido realizados esforços na obtenção de complexos cristalográficos. A PP2A é uma serina-treonina fosfatase que atua na célula como um importante supressor tumoral, exercendo sua atividade na forma de heterotrímeros formados por uma subunidade catalítica (PP2Ac), uma de ancoragem (PR65/A) e uma subunidade reguladora variável pertencente a uma dentre quatro famílias distintas (B/B¿/B" e striatins). O processo de montagem desses heterotrímeros é fortemente regulado por outras proteínas, e envolve modificações pós-traducionais no extremo C-terminal da PP2Ac em um processo conhecido como biogênese da PP2A. A proteína TIPRL inibe a atividade de PP2A e há evidências de que atue em algum ponto do processo de biogênese. Esta tese reporta avanços significativos no estudo da TIPRL e sua interação com a PP2Ac, dentre eles, a estrutura cristalográfica da TIPRL, determinada a partir de proteína marcada com Se-Met, uma vez que não havia qualquer informação estrutural disponível nos bancos de dados, que pudesse ser utilizada para Substituição Molecular. A estrutura apresenta um novo tipo de enovelamento e um inesperado sítio de interação com o C-terminal da PP2A, conforme indicam nossos estudos, realizados por mutagênese sítio-dirigida, pulldown e análise de troca hidrogênio/deutério acoplada a espectrometria de massas. Esses resultados permitiram, pela primeira vez, propor uma função biológica para a TIPRL na biogênese da PP2AAbstract: The incidence of cancer in the world population continually grows year after year, reaching alarming levels. Cancer is characterized by uncontrolled cell proliferation, originated from genetic and metabolic anomalies including changes in cell signaling mediated by the reversible phosphorylation of proteins, a highly regulated process mediated by protein kinases and phosphatases. The present work focused on studies of human phosphatases PP2A and PTP1B. The protein tyrosine phosphatase PTP1B is overexpressed in tumors and is involved in cancer and other diseases such as insulin resistance and type 2 diabetes, and is considered a good target for the development of new drugs. Accordingly, we analyzed several series of small molecules for inhibitory capacity, and efforts have been made to obtain crystallographic structures of enzyme-drug complexes. PP2A is a serine-threonine phosphatase that functions as a major cellular tumor suppressor and exerts its activity as heterotrimers consisting of a catalytic subunit (PP2Ac), a scaffolding (PR65/A) and a variable regulatory subunit belonging to one of four distinct families (B/B¿/B" and striatins). The assembly process of such heterotrimers is tightly regulated by other proteins, and involves post-translational modifications at the C-terminus of PP2Ac in a process known as PP2A biogenesis. The TIPRL protein inhibits PP2A activity and there is evidence that this protein might function in the biogenesis process. This thesis reports significant advances in the study of TIPRL and its interaction with PP2Ac, such as the crystal structure of TIPRL determined from Se-Met labelled protein since there was no structural information available in databases that could be used for Molecular Replacement. The structure presents a new folding and an unexpected site binding site for the C-terminus of PP2A, which was validated by site-directed mutagenesis, pulldown and of hydrogen/deuterium exchange analysis by mass spectrometry. These results allowed us to propose a biological role for TIPRL in the biogenesis of PP2ADoutoradoGenetica Animal e EvoluçãoDoutora em Genética e Biologia Molecular2011/03054-9141356/2011-1FAPESPCNP