Structural and functional characterization of the protein UDP-glucose pyrophosphorylase involved in the biosynthesis and accumulation of sucrose in sugarcane

Orientadores: Marcelo Menossi Teixeira, Ricardo AparicioTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O agronegócio da cana de açúcar movimenta cerca de R$ 40 bilhões por ano no Brasil. A cadeia produtiva da cana de açúcar como atividade na economia é responsável por 1,5% do produto interno bruto (PIB) nacional e um dos principais componentes econômicos é a quantidade de sacarose acumulada nos colmos. No entanto, a síntese de sacarose e sua acumulação em plantas superiores é o resultado do produto de uma extensa rede de interações. Quando descarregada nas células do parênquima de armazenamento, a sacarose é metabolizada por diferentes enzimas, sendo a UDP-glucose pirofosforilase (UGPase) uma das enzimas responsáveis pela síntese de sacarose em cana de açúcar. O objetivo deste trabalho foi avaliar o padrão de expressão do gene ScUGPase-1 e os mecanismos regulatórios que controlam a atividade da proteína UGPase de cana de açúcar. Análises por RT-qPCR revelaram que a expressão do gene ScUGPase-1 diminui ao longo da maturação dos colmos e o gene é mais expresso nos entrenós em comparação com o tecido de folha. Porém, nenhuma diferença de expressão significativa foi observada entre dois cultivares contrastantes em teor de sacarose. In vivo, a localização subcelular da proteína ScUGPase-1 indicou uma associação à membrana nos tecidos de folha e colmo. Utilizando anticorpo primário fosfo-específico, observamos a fosforilação da proteína ScUGPase-1 apenas na fração solúvel e microssomal do tecido de folha. In vitro, a proteína ScUGPase-1 formou um complexo com a proteína recombinante caseína quinase 1 (CK1) e sua atividade foi afetada por agentes óxido-redutores. Para complementar os dados de óxido-redução, análises de espalhamento de luz a baixo ângulo (SAXS) forneceram o primeiro modelo estrutural do dímero da proteína ScUGPase-1 em solução, destacando que a interface de dimerização está localizada na região C-terminal. Os dados indicam que a fosforilação, interação protéica e oligomerização podem exercem um papel importante na regulação da proteína ScUGPase-1 durante a síntese de sacarose em cana de açúcar.Abstract:The sugarcane agribusiness generates around R$ 40 billion per year in Brazil, while the entire supply chain of sugarcane is responsible for 1.5% of the gross domestic product (GDP). Sugarcane productivity is mainly determined by the accumulation of sucrose in the culms. However, the synthesis and accumulation of sucrose in plants is the result of an extensive network. When sucrose is unloaded in the storage parenchyma cells, it is metabolized by different enzymes, and UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase) is one of the enzymes responsible for the synthesis of sucrose in sugarcane. The objective of this work was to gain insights on the ScUGPase-1 expression pattern and the regulatory mechanisms that control protein activity. ScUGPase-1 transcript levels were negatively correlated with sucrose content in the internodes and only a slight difference in the expression pattern was observed between two cultivars that differ in their sucrose content. The intracellular localization of ScUGPase-1 indicated association with membranes in both leaves and internodes. Using a phospho-specific antibody, we observed that ScUGPase-1 was phosphorylated in vivo in the soluble and membrane fractions from leaves, but not from internodes. In vitro, the purified recombinant enzyme interacted with recombinant protein casein kinase 1 and its activity was affected by redox modification. To complement the redox data, Small-Angle X-ray Scattering provided the first structural model of the dimer of sugarcane UGPase in solution, highlighting that the dimer interface is located at the C-terminal. The data indicated that phosphorylation, protein interaction and oligomerization may play an important role in the regulation of ScUGPase-1 activityDoutoradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecula