Comparison studies between structure/function of two isolated PLA2s from the whole venom Botriopsis bilineata and Bothriopsis taeniata

Orientador: Sergio MarangoniTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Os venenos de serpentes são uma mistura complexa de moléculas funcionais sendo em sua maior parte proteínas. Para a perpetuação da espécie, e sendo selecionadas a partir do processo de seleção natural, as serpentes apresentam uma alta variabilidade de mutações gênicas responsáveis por expressar proteínas e componentes dos venenos ocorrendo um processo denominado de microevolução, com isso criou diversas toxinas com uma alta complexidade funcional e uma alta similaridade estrutural. Essas toxinas são responsáveis por uma grande variedade de efeitos farmacológicos que geram alterações fisiológicas e com isso imobilizando a presa (neurotoxicidade e miotoxicidade) impedindo a fuga do local de ataque, tendo componentes nos venenos que também iniciam a digestão da presa facilitando a alimentação da serpente. Estas toxinas têm sido utilizadas como ferramentas moleculares para uma melhor compreensão de processos fisiológicos. Através da identificação de modificações químicas em aminoácidos específicos e sequenciamento de "de novo" através de espectrometria de massas de PLA2s isoladas a partir do veneno de serpentes, foi possível correlacionar estrutura e função destas enzimas e elucidar certos mecanismos de ações farmacológicas específicas. As modificações químicas através dos reagentes p-BPB e AA da Bbil-TX foram identificadas e confirmadas por espectrometria de massas, apresentando um alto grau de eficiência e especificidade dos reagentes por aminoácidos específicos (lisina para o AA e histidina para o p-BPB). Após três etapas de purificação de uma nova PLA2 K49 isolada do veneno de Bothriopsis taeniata, denominada Btt-TX, esta foi submetida a duas diferentes enzimas de clivagem (tripsina e Lys-C) e os peptídeos gerados aplicados a um sistema de LC MS/MS aplicando-se diferentes métodos de fragmentação dos peptídeos digeridos como CID/HCD/ETD, com isso foi possível obter uma variedade de padrões complementares dos peptídeos fragmentados, sendo feito o sequenciamento "de novo" automático através da sobreposição dos peptídeos gerados pela combinação destas diferentes metodologias, permitindo obter 100% de cobertura da sequencia de aminoácidos. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-TerminalAbstract: The snake venoms are a complex mixture of functional molecules and in the most part of proteins. For the preservation of the species and suffering a natural selection process, the snakes show high genic variability responsible for the protein expressions and compounds present in the venom, occurring an microevolution process, in this way several toxins with a high functional complexity and structural similarity was created. These toxins are responsible for various pharmacological effects that produces many physiological disturbs (neurotoxicity and myotoxicity) which immobilize the prey keeping near from the local of the attack and having some venom components that start the digestion of the prey. Toxins are often used as a molecular tool to get a better comprehension of physiological process. Through identification of chemical modifications in specific amino acids and make a "de novo" sequence by mass spectrometry on isolated PLA2s from snake venom correlating function and structure of these enzymes trying to elucidate some specific pharmacological actions. All the chemical modification at the Bbil-TX by the reagents p-BPB and AA was identified and proved by mass spectrometry, showing a high level of efficacy and specificity of the reagents from specific amino acids (lysine for the AA and histidine for the p-BPB). After the purification of a new PLA2 K49 isolated from the Bothriopsis taeniata snake venom, called Btt-TX, submitting it to two different cleavage enzymes (trypsin and Lyc-C) and the generated peptides injected to an LC MS/MS system. Applying different fragmentation mode, such as, CID/HCD/ETD, it was possible obtain a variety of additional and complementary patterns of fragmented peptides. With the obtained data we did the "de novo" automatic sequence through the overlapping of the generated peptides from all the fragmentation methods, allowing to have 100%. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal. Our structure/function studies showed that the C-terminal region and the presence of the highly hydrophobic amino acid residues as well as the lisines presence are responsible for the anchorage and disrupt membrane, promoting the myotoxic effetc. The N-terminal loss in the Btt-TX, prove the importance of this region in anchoring with the cell membrane and increasing interaction with amino acids of these PLA2s, allowing a better interaction with the lisines increasing the penetration efficiency of the hydrophobic amino acids on C-terminal regionDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula