Analysis of DNA methylation status of LINE1 sequences and SFRP1 SFRP2 and TP73 genes in chronic periodontitis and oral cancer

Orientador: Ana Paula de Souza PardoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: A associação entre inflamação e câncer vem sendo há tempo estudada, havendo atualmente fortes evidências que mostram o microambiente inflamatório como fator de risco para tumorigênese. Dentre os tipos de câncer mais frequentes, o câncer de boca ocupa a sexta colocação como maior causa de óbitos em todo o mundo. Os fatores que levam ao aparecimento do câncer oral são variados, entretanto existe dependência de um acúmulo de mutações as quais levam a alterações genéticas e epigenéticas das células afetadas, sendo que estas alterações influenciam diretamente no prognóstico da doença. Nos últimos anos, o estudo das alterações epigenéticas relacionadas aos diversos tipos de câncers vem se destacando, havendo marcadores epigenéticos já descritos para diferentes tipos de tumores. Dentre as alterações epigenéticas mais estudadas está a metilação do DNA que acontecem normalmente em regiões com grandes concentrações de citocina que precedem guanina (CpG). Estas regiões ricas em dinucleotídeos CpGs são denominadas ilhas CG. Ilhas CG são frequentes em regiões promotoras dos genes, sendo a metilação um mecanismo de controle do nível transcricional. Ilhas CGs metiladas na região promotora são esperadas em genes pouco expressos, podendo haver até mesmo o completo silenciamento da expressão do gene. No caso de genes supressores de tumor, pode provocar o aparecimento e o descontrole no crescimento tumoral. Assim, o objetivo deste estudo foi analisar o padrão de metilação do DNA em sequências LINE1 e nos genes supressores tumorais: SFRP1, SFRP2 e TP73, em amostras de gengiva coletadas de pacientes, pacientes com periodontite crônica e pacientes diagnosticados com carcioma espinocelular (CEC). A metilação do DNA foi analisada utilizando-se a metodologia COmbined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) em tecidos homogeneizados e microdissecados. A análise de expressão gênica dos genes foi realizada pela técnica qPCR amostras de tecido gengival e CEC. Os resultados obtidos pelas análises COBRA evidenciaram um desequilíbrio no estado de metilação todo DNA anto nos tecidos inflamados quanto nos tumorais. Entretanto, as regiões CpG analisadas não demonstraram estar diretamente relacionadas com o nível de expressão gênica. Adicionalmente, os resultados das análises da metilação global (LINE1) do tecido homogeneizado em comparação com as amostras microdissecadas indicam que os dados obtidos podem ser contraditórios aos reais podendo interferir no prognóstico do paciente. Esta contradição possivelmente se deve a contaminação do tecido tumoral por tecidos adjacentes a ele. As análises estatísticas dos resultados foram realizadas pelos testes Kruskall-Wallis e correlação de Pearson ao nível de significância de 5%. Alterações no padrão de metilação do DNA dos genes estudados são encontradas tanto em tecidos inflamados quanto em amostras de câncer bucal. A metodologia de escolha para análise destes tecidos pode influenciar nos resultados obtidos, gerando falsos negativos e consequentemente comprometendo o tratamento da doençaAbstract: The association between inflammation and cancer has always been sought by researchers. Nowadays, there are evidences of the role of the inflammatory microenvironment in tumorigenesis. Among the most common types of cancer, oral cancer is the sixth type that causes more deaths worldwide. The factors that lead to the development of an oral cancer are varied, depending on an accumulation of mutations that lead to genetic and epigenetic alterations of the affected cells, and these changes directly influence the prognosis of the disease. In recent years epigenetic have been widely studied in this field of researchs, and several genes have been described as markers for different types of tumors. Among the most studied epigenetic changes there is the DNA methylation in areas with large concentrations of the cytokine that precedes guanine (CpG), these regions are called CpG islands. GpC islands are fairly common in the promoter regions of the genes, being the methylation a control mechanism of gene level transcripts and it can even silence the expression of a gene. In the case of tumor suppressor genes this silencing can lead to uncontrolled tumor growth. The aim of this study was to analyse the DNA methylation status of LINE1 sequences and specific genes (SFRP1, SFRP2 e TP73) from human tissue collected from gingival normal tissue from patients underwent aesthetic surgery, patients with cronic periodontitis and patients with oral squamous cell carcinoma (OSCC). The extracted DNA was analysed by Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) submitting the DNA to bisulfite conversion by MethylSEQrBisulfiteConversion Kit from homogenized and microdissected tissues. Through qPCR technique, samples from gingival tissue and OSCC were subjected to RNA expression analysis of candidate genes. The results of COBRA analysis of genes exhibited an imbalance in methylation state of inflamed and tumor tissues. However, the CpG regions analyzed have not shown to be directly related to the level of expression of these genes. The results of the analysis of the global methylation (LINE1) of the homogenized tissue compared with microdissected samples showed that the obtained data may be contradictory to the real one and may interfere in the prognosis of the patient. This inconsistency is probably due to contamination of tumor tissue by adjacent tissues. Statistical analysis of results was performed by Kruskal-Wallis test and Pearson correlation at the 5% confidence level. Changes in DNA methylation pattern of the genes studied are found in both inflamed tissues as oral cancer samples. The choice of methodology for the analysis of these tissues can influence results, and consequently generating false negative results affecting the treatment of diseaseDoutoradoHistologia e EmbriologiaDoutora em Biologia Buco-Denta