Site-directed mutagesesis in an avian pathogenic Escherichia coli (APEC) isolated from a swollen head sindrome case : analisis in vitro and in vivo

Orientadores: Wanderley Dias da Silveira, Marcelo BrocchiTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Escherichia coli patogênica para aves (APEC) é responsável por inúmeras perdas no setor avícola mundial, por causar uma série de doenças nas aves que se apresentam de forma sistêmica ou localizada as quais são, coletivamente, denominadas colibacilose. Os mecanismos de virulência destas linhagens patogênicas para aves e, possivelmente, patogênicas para seres humanos ainda não foram totalmente elucidados. Este trabalho foi desenvolvido com o intuito de estudar genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade de uma linhagem APEC causadora de Síndrome da Cabeça Inchada (SCI-07) ONT:H31, a partir de resultados obtidos em um microarranjo realizado in vitro, o qual comparou a linhagem em estudo à linhagem padrão E. coli EHEC 8624 (linhagem enterohemorrágica). Nove genes, detectados como sendo super-expressos no microarranjo, nas condições estudadas, foram selecionados para construção de mutantes nulos e de seus complementos [feoA (transporte de ferro), nirC (transportador de nitrito), flgE ( gancho flagelar), tyrR (regulador de transcrição da síntese de aminoácidos aromáticos), potF (subunidade periplasmática do transportador putrescina), yehD (possível fimbria), bfr (bacterioferrina), csgA ( subunidade principal da curlina) e entD (enteroquelina)]. Os mutantes construídos foram avaliados quanto as suas capacidades de adesão e invasão em cultivos celulares, e quanto ao seu potencial patogênico em aves de um dia de idade em comparação à cepa selvagem. As linhagens ?bfr, ?csgA e ?nirC apresentaram diminuição da capacidade de adesão em fibroblastos de aves (linhagem FEG) em comparação à linhagem selvagem em ambos os modelos adotados: na presença e ausência de alpha-D-mannopyranoside; a linhagem ?potF apresentou diminuição da adesão apenas na ausência de alpha-D-mannopyranoside. Os mutantes ?csgA e ?tyrR apresentaram redução na capacidade de invadir linhagem de células de trato respiratório humano (linhagem Hep-2). Nenhum mutante avaliado mostrou alteração na capacidade de invadir fibroblastos de aves (linhagem CEC-32). Os mutantes ?flgE e ?tyrR mostraram diminuição na capacidade de invadir e sobreviver em macrófagos de aves (linhagem HD11). A motilidade das linhagens mutantes ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC e ?feoA foi aumentada enquanto o mutante ?tyrR mostrou redução de motilidade e o mutante ?flgE tornou-se imóvel. Nenhuma linhagem mutante obtida mostrou a mesma capacidade da linhagem selvagem em causar mortalidade em aves de um dia; ?feoA tornou-se hipervirulenta e todos os demais mutantes apresentaram atenuação em diferentes graus, sendo a linhagem ?entD totalmente atenuada e, portanto, promissora quanto ao seu uso como linhagem vacinal.para o combate à colibacilose em aves, ou como linhagem carreadoras de epítopos presentes em outras linhagens APECAbstract: Avian Pathogenic Escherichia coli (APEC) is responsible for significant economic loses in the poultry industry worldwide, by cause a range of systemic or localized diseases in poultry collectively termed colibacillosis. The virulence mechanisms of these pathogenic strains for poultry and possibly pathogenic for humans have not been fully elucidated. This work was developed in order to study genes potentially involved in the pathogenicity of an APEC strain isolated from a Swollen Head Syndrome case (SCI- 07) ONT:H31; since the results obtained in a microarray performed in vitro, which compared the SCI-07 strain to the standard strain E. coli 8624 EHEC (enterohemorrhagic strain). Nine overexpressed genes in microarray under the conditions studied were selected for construction of null mutants and their complements [feoA (iron transport), nirC (nitrite transporter), flgE (flagellar hook), tyrR (transcriptional regulator of the aromatic amino acids biosynthesis), potF (periplasmic putrescine transporter subunit), yehD (putative adhesin), bfr (bacterioferritin), csgA (major curling subunit) and entD (enterochelin)]. The mutants constructed were evaluated for their capacity for adhesion and invasion in cell cultures, and for its pathogenic potential in one-day-old chickens in comparison to the wild type strain (WT). The ?bfr, ?csgA and ?nirC strains showed decreased adhesion capacity on avian fibroblasts (CEF cells) compared to the WT in both models adopted: in the presence and absence of alpha-D-mannopyranoside, the ?potF strain showed decrease on adhesion only in the absence of alpha-D-mannopyranoside. The ?csgA and ?tyrR mutants had reduced ability to invade human larynx cell line (Hep-2 cells). No mutant showed changes in the capacity of invade avian fibroblasts birds (CEC-32cells). The ?flgE and ?tyrR mutants showed decreased ability to invade and survive into avian macrophages (HD11 cells). The motility of mutant strains ?csgA, ?bfr, ?yehD, ?potF, ?entD, ?nirC and ?feoA was increased while the ?tyrR mutant showed reduced motility and the mutant ?flgE became nonmotile. No mutant strain showed the same capacity of the WT in cause mortality in one-day-old chickes; ?feoA became hipervirulenta and all other mutants showed attenuation in different degrees, including the ?entD that was completely attenuated and a promising vaccine candidate strain to combat colibacillosis in poultry, or as a carrier strain of epitopes present in other APEC strainsDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutora em Genética e Biologia Molecula