Differential gene expression induced by elicitors (chitosan and salicylic acid) in citrus-Xanthomonas citri subsp. citri and citrus-Xylella fastidiosa pathosystems

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Alessandra Alves de SouzaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Avaliou-se as alterações transcricionais em laranja 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.) promovidas por quitosana (CHI) e ácido salicílico (SA), utilizando RNA-seq, e o efeito destes compostos no controle do cancro cítrico (Xanthomonas citri subsp. citri) e da clorose variegada dos citros (CVC - Xylella fastidiosa). As plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, foram coletadas amostras foliares para avaliar seus transcriptomas. Para a avaliação dos eliciadores sobre o cancro cítrico e a CVC, as plantas foram tratadas com CHI ou SA e após 48h e 24h, respectivamente, inoculadas com as duas bactérias separadamente. A partir de 24h da inoculação, foram coletadas amostras foliares para avaliar a curva de crescimento de ambas as bactérias, a redução da severidade e/ou incidência das doenças e respostas de defesa da planta por RT-qPCR. Com os resultados do transcriptoma, observou-se que mais genes foram induzidos pelo tratamento com SA do que com CHI. O tratamento com SA aumentou a expressão de genes que participam da via de sinalização do SA na planta (WRKY50, PR2 e PR-9) e genes da biossíntese do etileno e ácido jasmônico (ACS 12, fator de transcrição contendo domínio AP2 e OPR3). Além disso, promoveu a indução de genes relacionados ao metabolismo secundário, processos redox e estresse biótico. No tratamento com CHI, foi observada maior indução de genes relacionados ao metabolismo secundário. Para ambos os tratamentos, a via da auxina foi reprimida. No experimento para controle do cancro cítrico, observou-se que ambos os eliciadores promoveram reduções na severidade e incidência da doença. Entretanto, a CHI pareceu não interferir diretamente na formação do biofilme pela bactéria, mas pode ter dificultado a multiplicação de X. citri na planta. O SA retardou a entrada da bactéria na planta e, aparentemente, inibiu mais a formação do biofilme bacteriano do que a CHI. Comparações da expressão gênica entre os eliciadores reforçam a ideia de que a CHI tem maior potencial de induzir resistência ao cancro cítrico do que SA. No experimento para o controle da CVC, observou-se que a CHI induziu importantes genes da via do SA (NPR1, TGA, EDS1) e etileno (EIN-3, PR-4) 24h após a inoculação. Aplicações exógenas de SA potencializaram o seu efeito endógeno na planta, pois houve indução de NPR1, TGA e PRs. Entretanto, não foi possível estabelecer uma relação clara entre a multiplicação de X. fastidiosa, a incidência da doença e o uso da CHI e SA em laranja 'Pera', já que na maioria das avaliações não houve redução da população bacteriana em amostras foliares e não houve redução da incidência em plantas tratadas. Com base nos resultados, observou-se que CHI e SA induziram diversos genes envolvidos em respostas de defesa em laranja 'Pera'. Entretanto, essas respostas podem ser moduladas diferencialmente a depender do patógeno que afeta a planta, pois os eliciadores foram eficientes no controle da X. citri, um patógeno que coloniza o mesófilo da planta, entretanto não foram efetivos no controle da X. fastidiosa, um patógeno que coloniza o xilema da planta, embora respostas de defesa tenham sido expressas nos momentos iniciais (24h) após a inoculação com X. fastidiosaAbstract: This study was carried out to evaluate transcriptional modification in sweet orange 'Pera' (Citrus sinensis L. Osb.), promoted by chitosan (CHI) and salicylic acid (SA), using RNA-seq, and the effect of these compounds on citrus canker (Xanthomonas citri subsp. citri) and citrus variegated chlorosis (CVC - Xylella fastidiosa). Plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, leaf samples were collected to assess the transcriptome. In the experiments for disease assessment, the plants were treated with CHI or SA and after 48h and 24h, respectively, inoculated. Starting from 24h after inoculation, leaf samples were collected to evaluate the multiplication of the pathogens (X. citri and X. fastidiosa), reduction of the severity and / or incidence and plant defense responses by RT-qPCR. Based upon the transcriptome results, it was observed that more genes were induced by SA than by CHI. SA treatment increased the expression of genes that participate in the SA signaling pathway in the plant (WRKY50, PR2 and-PR9), and genes involved in the biosynthesis of ethylene and jasmonic acid (ACS 12, transcription factor containing AP2 and OPR3 domain). Besides these, SA promoted induction of genes of secondary metabolism, redox processes and biotic stress. The treatment with CHI exhibited higher induction of genes related to secondary metabolism. For both treatments, the auxin pathway was suppressed. In the experiment for the control of citrus canker, it was observed that both elicitors reduced the severity and incidence of the disease. However, CHI seems not to interfere directly in biofilm formation, but may have hindered the multiplication of X. citri in the plant. The SA slowed down the entry of the bacteria into the plant and, apparently, inhibited the formation of biofilm more efficiently than the CHI. Comparisons of gene expression between elicitors reinforce the idea that CHI has higher potential to induce resistance to citrus canker than SA. In the experiment for the control of CVC, it was observed that the CHI induced important genes of the SA (NPR1, TGA, EDS1) and ethylene (EIN-3, PR-4) pathways 24h after inoculation. Exogenous applications of SA potentiated its endogenous effect in the plant, since there was induction of EDS-1, NPR1, TGA and PRs. However, it was not possible to establish a clear relationship between the multiplication of X. fastidiosa, the incidence of the disease and the use of CHI and SA in 'Pera' sweet orange, since most of the assessments did not show reduction of bacterial populations in leaf samples and there was no reduction of the incidence in treated plants. Based upon the results of this study, it was observed that CHI and SA induced several genes involved in defense responses in 'Pera' sweet orange. However, these responses can be modulated differentially depending on the pathogen that affects the plant. This fact was demonstrated in this study, as elicitors were effective in controlling X. citri, a pathogen that colonizes the mesophyll of the plant, but were not effective in controlling X. fastidiosa, a pathogen that colonizes the xylem of the plant, although defense responses were expressed in the early stages (24 h) after inoculation with X. fastidiosaDoutoradoBioquimicaDoutora em Biologia Funcional e Molecula