Effect of different protocols of low-power laser on the healing of rats Achilles tendon after partial transection

Orientador: Edson Rosa PimentelTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O tendão calcanear é o tendão mais acometido por ruptura, particularmente em atividades esportivas. O processo de cicatrização resulta em uma matriz extracelular (MEC) menos organizada o que reduz sua resistência à tensão e torna-o mais susceptível à recorrência de lesões. A terapia com o laser de baixa potência (LBP) tem se mostrado efetiva, porém existem resultados contraditórios com relação a seus protocolos. Propusemos-nos a avaliar os efeitos de diferentes terapias com o LBP em tendão calcanear parcialmente seccionado. Para tal foram utilizados ratos Wistar machos adultos, distribuídos em 7 grupos experimentais: G1- Tendão intacto; G2-Tendão seccionado; G3- lesão + LBP (4J/cm2-contínuo); G4- lesão + LBP (4J/cm2-20 Hz); G5- Tendão seccionado; G6- lesão + LBP (4J/cm2-contínuo); G7- lesão + LBP (4J/cm2-20 Hz até o 7º dia e 2 KHz do 8º ao 14º dia). G2, G3 e G4 foram eutanaziados no 8º dia após lesão, e G5, G6 e G7 no 15º dia. Foram realizadas as dosagens de proteínas não-colagênicas (PNC), glicosaminoglicanos (GAG) e hidroxiprolina (HOPro), além de eletroforese em gel de agarose, zimografia para MMP-2 e -9 e western blotting (WB) para colágeno I e III. O estudo estrutural foi feito por meio de lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE) e azul de toluidina (AT) além de análise e medidas de birrefringência por meio de microscopia de polarização. A análise funcional foi realizada por meio do Catwalk. Com relação à HOPro houve um decréscimo significativo em todos os grupos quando comparados ao G1, exceto G7. A dosagem de GAG revelou um aumento em todos os grupos exceto G5 e o gel de agarose mostrou um aumento no conteúdo de dermatan sulfado em todos os grupos transeccionados, sendo menos expressivo em G4 e G7. Nos cortes corados com AT os grupos transeccionados apresentaram maior metacromasia, em especial os grupos tratados. WB para colágeno I mostrou um aumento em G4 e G7. Quanto ao colágeno III G4 apresentou valores maiores quando comparado a G2. A zimografia para MMP-2 indicou maiores valores em G4 e G7. A MMP-9 aumentou em G3 e G4. A análise de birrefringência revelou acentuada desorganização em todos os grupos, com melhora significativa em G7. Os resultados do catwalk apontaram que, após a cirurgia os grupos que receberam o laser pulsado conseguiram apoiar melhor a pata quando comparado aos demais grupos. Nossos resultados mostram que o LBP contínuo e pulsado tem efeitos diferentes sobre o processo de reparo do tendão. O LBP pulsado atuou sobre o processo inflamatório possibilitando que o animal apoiasse melhor a pata ao caminhar e promoveu a síntese e organização do colágeno. Desta maneira acreditamos que este protocolo de tratamento pode ser adaptado para o uso em clínicas de reabilitação de maneira a acelerar o reparo e melhorar as características morfológicas, bioquímicas e funcionais deste tendãoAbstract: The Achilles tendon has a high incidence of rupture, particularly in sports activities. The healing process leads to a disorganized extracellular matrix (ECM) which reduces its tensile strength and lead to a high rate of injury recurrence. Low level laser therapy (LLLT) has been effective, but there are conflicting results regarding their protocols. Our purpose was to evaluate the effects of different therapies with LLLT in partially tenotomized Achilles tendon. Adult male Wistar rats were divided into 7 groups: G1 ? intact; G2 ? injured; G3 ? injured + LLL (4 J/cm2 continuous); G4 ? injured + LLL (4 J/cm2 ? 20 Hz); G5 ? injured; G6 ? injured + LLL (4 J/cm2 continuous); and G7 ? injured + LLL (4 J/cm2 ? 20 Hz until the 7th day and 2 kHz from 8?14 days). G2, G3 and G4 were euthanized 8 days after injury, and G5, G6 and G7 were euthanized on the 15th day. Quantification of non-collagenous protein (NCP), glycosaminoglycans (GAG) and hydroxyproline (HOPro) was performed, in addition to electrophoresis on agarose gel, zymography for MMP-2 and -9, western blotting (WB) for collagen types I and III. The structural analysis was done by hematoxylin-eosin (HE) and toluidine blue (TB) staines with in addition to birefringence measurements and analysis by polarization microscopy. Functional analysis was performed using the gait assessment of the animals in the Catwalk. Regarding HOPro there was a significant decrease in all groups when compared to the G1, except G7. The dosage of GAG showed an increase in all groups except G5 and agarose gel showed an increase in the content of dermatan sulfat in all transected groups, being less expressive in G4 and G7. In sections stained with TB the tenotomized groups showed metachromasia, particularly the treated groups. WB for collagen I showed an increase in G4 and G7. In G4 collagen III showed higher values when compared to G2. The zymography for MMPs-2 showed higher values for G4 and G7. MMP-9 increased in G3 and G4. Analysis of birefringence showed marked disorganization in all groups, with a significant improvement in G7. The catwalk results showed that after surgery, G4 had better results when compared to other groups. Our results show that the continuous and pulsed LLLT has different effects on the process of tendon repair. Pulsed laser acted on the inflammatory process improving the gait and promoting collagen synthesis and organization. Thus we believe that this treatment protocol can be adapted for use in rehabilitation clinics in order to accelerate the repair and enhance the morphological, biochemical and functional characteristics of the tendonDoutoradoAnatomiaDoutora em Biologia Celular e Estrutura