Analysis of promoter region of the gene CsEXP as one of the possible sites of interaction genetic in citrus canker development involved in signaling auxin pathway, and studies of CsARF protein from Citrus sinensis

Orientador: José Camillo NovelloDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O Brasil é o maior produtor de citros no mundo, entretanto, várias doenças ameaçam a citricultura brasileira, dentre elas o cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc). A doença é caracterizada por necrose e lesões eruptivas. Sabe-se que a bactéria transloca proteínas efetoras para o interior da célula hospedeira e modula a transcrição na planta. Dentre as proteínas translocadas está à proteína PthA que por si só é capaz de induzir hiperplasia e hipertrofia tecidual. Em relação aos genes cuja expressão foi induzida pela infecção por X. citri estão àqueles envolvidos na remodelação da parede celular, síntese, mobilização e sinalização de auxina e giberelina, os quais são os principais hormônios vegetais controladores de crescimento celular. Corroborando com isso, tanto auxina como giberelina ativam a expressão de celulases e expansinas e são necessárias para o desenvolvimento do cancro cítrico. Em 2010 demonstrou-se a interação entre PthAs e a proteína ARF ("auxin response fator") de Citrus sinensis (CsARF), um possível repressor da via de auxina. O promotor do gene da expansina de citros (CsEXP), cujo gene foi induzido por X. citri e auxina contêm uma sequência similar aos chamados AuxRe, elementos cis-regulatórios de resposta à auxina, localizado adjacentemente ao provável TATA-"box". Sendo assim, analisou-se a região 5' a montante do gene CsEXP de C. sinensis a fim de saber se este representa de fato o promotor mínimo do gene e se o "box AuxRE-like" funciona como elemento regulatório de resposta à auxina. No ensaio de transformação de CsEXP para ativação do gene repórter GUS, a região promotora foi responsiva à auxina, havendo, portanto uma regulação positiva do gene pelo hormônio. Há uma interação (sinergismo) entre a proteína PthA2 e/ou PthA4 com auxina na regulação da transcrição. Esta região que contém o "box AuxRE-like" possui uma sequência TGTCTA a qual está justaposta ao possível TATA-box no promotor do gene podendo se tratar de uma região de provável co-interação entre as duas proteínas. As proteínas CsARF e PthA2, em ensaios gel "shift", demonstraram afinidade por esta região, o que corrobora com a hipótese de co-interação nessa região. Os resultados demonstram que esta região do DNA mostra se como importante alvo de estudo, envolvendo interações correlacionadas com o desenvolvimento da doençaAbstract: Brazil is the biggest in the world in the citrus production, but many diseases threaten the Brazilian citrus cultivation, among them the citric canker, a disease characterized by hyperplastic lesions on the host surface, having Xanthomonas citri subsp. citri (Xcc) as the causal agent of citrus canker. It is known that the bacterium translocates effector proteins into the host cell to modulate transcription in the plant, including the PthA protein which itself is capable of inducing tissue hyperplasia and hypertrophy. Recently, it was shown that X. citri induces the expression of genes involved in cell wall remodeling, synthesis, mobilization and signaling of auxin and gibberellic acid, main plant hormones controlling cell growth and division. Furthermore, auxin and gibberellin are capable to activate the expression of cellulases and expansins and both of them are necessary for the development of citrus canker. Moreover, we verified the interaction between PthA and the protein ARF (auxin response factor) of Citrus sinensis (CsARF), and that promoter of the gene of expansins citrus (CsExp) it was induced by X. citri and auxin, which contains a sequence similar to known AuxRe, cis-regulatory elements in response to auxin, located adjacent to the probable TATA-box. Therefore, we analyzed the 5' region upstream of the gene CsExp of C. sinensis in order to know if in fact represents the minimal promoter of the gene and if AuxRE-box-like functions as regulatory element in response to auxin._ In the test transformation of CsEXP for activating GUS, the promoter region was responsive to auxin, the results were promising, because the minimal promoter of the gene was responsive to auxin in vivo assays, which have confirmed the activation of the reporter gene by auxin, with therefore an upregulation of the gene by the hormone. There is a synergy between the proteins PthA2 and PthA4 with auxin in the regulation. This region contains the AuxRE-like-box which has a sequence TGTCTA which is juxtaposed to the potential TATA-box within the promoter of the gene, possibly being a region of likely joint-interaction for the two proteins._PthA2 and CsARF Proteins in gel shift tests demonstrated affinity for this region, which could confirms the hypothesis of the region to be a region of jointinteraction. The results were significant and this region of the DNA shown to be an important target for study of interactions likely correlated with the development of the diseaseMestradoBioquimicaMestra em Biologia Funcional e Molecula