Investigation of microorganisms and endotoxins in intraradicular infections associated with failure endodontic treatment before and after chemo-mechanical preparation

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida GomesTese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Introdução: Microrganismos resistentes à terapia endodôntica ou que invadiram o sistema de canais radiculares após os procedimentos clínicos de desinfecção são considerados as principais causas do insucesso endodôntico. Objetivos: 1) investigar a prevalência de Enterococcus faecalis nos casos de retratamento endodôntico e lesão periapical utilizando a técnica de cultura, PCR tradicional e nested PCR, e avaliar a suscetibilidade antimicrobiana e os fatores de virulência dos E. faecalis isolados dos canais radiculares investigados (Capítulo 1); 2) quantificar bactérias viáveis e endotoxinas em dentes com infecções endodônticas secundárias e correlacionar seus níveis com aspectos clínicos e radiográficos, e também avaliar o efeito do preparo químico-mecânico (PQM) com clorexidina 2% gel + EDTA 17% na redução de bactérias e endotoxinas. Também visou investigar determinadas espécies bacterianas Gram-negativas por meio da técnica de PCR (Capítulo 2). Métodos: Amostras microbiológicas foram coletadas de 30 canais radiculares de dentes com tratamento endodôntico prévio e lesão periapical após a remoção da guta-percha (C1) e após o PQM (C2). Técnicas de cultura microbiana, PCR (16S rDNA) e nested PCR foram empregadas para investigação de E. faecalis. Determinadas espécies bacterianas Gram-negativas foram investigadas por meio da técnica de PCR. Níveis de endotoxinas e unidades formadoras de colônias (UFCs) foram monitorados em C1 e C2, utilizando o método LAL e cultura, respectivamente. Cepas clínicas de E. faecalis foram testadas quanto sua suscetibilidade antimicrobiana frente a 12 tipos de antibióticos por meio do E-test. Fatores de virulência (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp e cylA) dos E. faecalis isolados foram investigados pela técnica de PCR. Resultados: E. faecalis foi encontrado pela técnica de cultura (7/30), PCR tradicional (13/30) e nested PCR (23/30). PCR tradicional e nested PCR revelaram maior sensibilidade do que a cultura na detecção de E. faecalis (p<0,05, teste McNemar). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15), T. denticola (1/15), T. socranskii (1/15) e T. forsythia (2/15) foram detectadas nos canais radiculares. Endotoxinas foram detectados em todos os casos (C1 e C2). Correlação positiva entre níveis de endotoxinas e destruição óssea periapical foi observada (p<0,05). E. faecalis apresentou-se suscetível frente à Amoxicilina, Amoxicilina + ácido clavulânico, Benzilpenicilina, Moxifloxacina e Vancomicina, entretanto algumas cepas mostraram resistência contra Eritromicina (3/12), Azitromicina (8/12), Rifampicina (4/12), Tetraciclina (2/12) e Doxiciclina (1/12). Foram encontrados os seguintes fatores de virulência nos E. faecalis isolados: ace e efaA (100%), gelE (91,6%), asa (83,3%), esp (25%) e cylA (16,6%). Conclusão: 1) A percentagem de E. faecalis encontrada variou dependendo da técnica empregada. Todos os E. faecalis isolados apresentaram fatores de virulência relacionados à aderência (genes ace e efa). Foi observada resistência frente a alguns antibióticos comumente utilizados na Odontologia (Capítulo 1); 2) Foram encontrados microrganismos e endotoxinas em todos os canais radiculares, antes e após o PQM. Os níveis de endotoxinas presentes inicialmente nos canais apresentaram associação com o tamanho da lesão periapical. O PQM com clorexidina 2% gel + EDTA 17% foi efetivo na redução da carga bacteriana e dos níveis de endotoxinas nos casos de infecção endodôntica secundária. (Capítulo 2)Abstract: Introduction: Microorganisms resistant to the endodontic therapy or that invaded the root canal system after clinical disinfection procedures are considered the main causes of endodontic failure. Aims: 1) to investigate the prevalence of E. faecalis in cases of endodontic retreatment with periapical lesions using culture technique, traditional PCR and nested PCR; and also to evaluate the antimicrobial susceptibility and virulence factors of E. faecalis isolates (Chapter 1); 2) to quantify cultivable bacteria and endotoxin in root canals with secondary endodontic infection correlating their levels with the presence of clinical features; and also to evaluate the effect of chemomechanical preparation (CMP) with 2% chlorhexidine-gel + 17% EDTA on bacterial and endotoxin removal. Moreover, it was also aimed to investigate the presence of target strict Gram-negative anaerobic bacteria by PCR/ nested PCR (Chapter 2). Methods: Microbial samples were collected from 30 root-filled canals of teeth with secondary endodontic infection after removal of gutta-percha (S1) and after CMP (S2). Microbial culture techniques, PCR (16S rDNA) and nested PCR were used to investigate the presence of E. faecalis. Target Gram-negative bacteria species were investigated by PCR. Levels of endotoxin and CFU were monitored in S1 and S2, using the LAL assay and culture, respectively. Clinical strains of E. faecalis were tested for their antimicrobial susceptibility to 12 types of antibiotics by E-test. The virulence factors (efaA, ace, asa, asa373, gelE, esp and cylA) of E. faecalis isolates were investigated by PCR technique. Results: E. faecalis was found by culture technique (7/30), traditional PCR (13/30) and nested PCR (23/30). The traditional PCR and nested PCR technique revealed higher sensitivity for detection of E. faecalis than culture (p<0.05, McNemar's test). P. nigrescens (4/15), P. intermedia (2/15), F. nucleatum (1/15) T. denticola (1/15) T. socranskii (1/15) and T. forsythia (2/15) were detected in the root canals investigated. Endotoxins were detected in all cases (S1 and S2). Positive correlation between endotoxin levels and periapical bone destruction was observed (p