RHD allelic identification among D-brazilian blood donors as a routine test using pools of DNA

Orientador: Lilian Maria de CastilhoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Alelos RHD que levam à redução da expressão do antígeno D na superfície dos eritrócitos podem levar à tipagem errônea como D- por técnica sorológica e podem causar imunização anti-D quando transfundidos em pacientes. A fim de determinar a ocorrência de tais alelos em doadores de sangue aparentemente D-, foi implementada técnica molecular de rotina utilizando um pool de DNAs de doadores de sangue. Um total de 2450 amostras previamente tipadas como D- foram testadas em pools de 10 amostras para o polimorfismo RHD específico, intron 4 e éxon 7. Nos pools que apresentaram resultado de PCR positivo, as amostras foram reavaliadas individualmente utilizando PCR exon-específico, métodos sorológicos e sequenciamento genético. Dentre as 2.450 amostras de doadores D- testadas, 101 (4,1%) carreavam o gene RHD. Foi identificada a presença de RHD não funcional (RHD'psi', RHD*CE(2-9)-D e RHD*CE(3-7)-D), diferentes alelos de D fraco tais como RHD*weak D type 1, RHD*weak D type 4.3, RHD*weak D type 5, RHD*weak D type 38 e RHD*DEL. Uma metodologia utilizando a técnica de PCR foi empregada como teste de rotina para o gene RHD utilizando pools de 10 amostras de DNA de doadores de sangue. Foi possível a integração da genotipagem RHD em programas de triagem de rotina utilizando pools de DNA. Como resultado, 19 (0,8%) dos doadores de sangue que carreavam fenótipos D fraco ou Del, com potencial de causar imunização anti-D em receptores, foram reclassificados como D+. Entretanto, seria necessário adaptar a estratégia de genotipagem RHD ao espectro de alelos prevalente em cada populaçãoAbstract: RHD alleles leading to a reduced expression of D antigen of the red blood cell (RBC) surface may be erroneously typed as D negative by serology and may cause anti-D immunizations when transfused to recipients. We have therefore investigated the occurrence of such alleles among apparent D negative blood donors, molecular typing was implemented as a routine test using a pool of DNA. A total of 2,450 pretyped D negative samples was tested in pools of 10 for the RHD-specific polymorphism in intron 4 and exon 7. Samples in PCR positive pools were individually reevaluated by exon-specific PCRs, sequencing and serologic methods. Our results showed that among 2,450 serologically D negative blood donor samples tested, 101 (4.1%) carried the RHD gene. Nonfunctional RHD (RHD*'psi', RHD*CE(2-9)-D and RHD*CE(3- 7)-D), different weak D alleles such as RHD*weak D type 1, RHD*weak D type 4.3, RHD*weak D type 5, RHD*weak D type 38 and RHD*DEL were identified. We employed a PCR-based assay for RHD as a routine test using pools of 10 DNA blood donor samples. The integration of RHD genotyping into the routine screening program using pools of DNA samples was straightforward. As a consequence, 19 (0.8%) blood donors carrying a weak D and Del phenotypes with the potential of causing anti-D immunizations in recipients were reclassified as RhD positive. For each population, it would be necessary to adapt the RHD genotyping strategy to the spectrum of prevalent allelesDoutoradoClinica MedicaDoutora em Ciência