Oxidative stress susceptibility to permeability transition precede the onset of autoimmune diabetes in nod mice

Orientadores: Aníbal Eugênio Vercesi, Helena Coutinho Franco de OliveiraTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: Espécies reativas de oxigênio (EROs) tem sido associado com uma grande variedade de doenças metabólicas humanas incluindo o diabetes tipo 1 auto-imune (DM1A). A destruição das células beta pancreáticas no DM1A está associada com estresse oxidativo celular no qual a morte celular ocorre via mitocondrial. O objetivo desse trabalho foi determinar se o estresse oxidativo e a disfunção mitocondrial estão presentes no modelo experimental de DM1A, camundongos NOD (não obeso diabetico) e se isso está relacionado com o desenvolvimento da doença. Foram realizados experimentos em biópsias de fígado e músculo sóleo, mitocôndrias isoladas de fígado, linfócitos de baço e circulante, células tronco de medula óssea e ilhotas pancreáticas isoladas de camundongos NOD e camundongos Balb/c. Os camundongos NOD foram estudados nas três fases da doença: não diabéticos (glicemia 250 mg/dL, 14-25 semanas de vida) comparados aos camundongos Balb/c nas idades correspondentes. A respiração mitochondrial (consumo de oxigênio) foi medida no estado de fosforilação e repouso nas biópsias de fígado e músculo sóleo e em mitocôndrias isoladas e não foram diferentes em camundongos NOD nos três estágios em comparação com os Balb/c nas mesmas idades. Entretanto, as mitocôndrias isoladas de NOD mostraram ser mais susceptível a transição de permeabilidade mitocondrial (TPM) induzida pelo cálcio e sensível a ciclosporina A, determinado por inchamento mitocondrial e pela diminuição da capacidade de retenção de cálcio. Essa maior susceptibilidade a TPM foi observada nos três estágios de desenvolvimento do DM1A. Produção de peróxido de hidrogênio (Amplex red) foi maior nas mitocôndrias isoladas de NOD não-diabéticos, mas não foi alterada nos estágios pré-diabético e diabético. A oxidação do H2DCF pelas células intactas, foi significativamente maior nos linfócitos e células tronco de NOD não-diabéticos, pré-diabéticos e diabéticos comparadas ao controle. Além disso, observamos maiores taxas de oxidação do H2DCF em ilhotas pancreáticas de NOD não-diabéticos. Esses resultados sugerem que o estresse oxidativo precede o desenvolvimento da doença e pode ser a causa da disfunção mitocondrial que está envolvida na morte das células beta. Propomos que o estresse oxidativo é um evento chave na patogênese da DM1A e pode ser um alvo potencial para intervençõesAbstract: Reactive oxygen species (ROS) have been extensively associated with a large variety of human metabolic diseases including type 1 diabetes auto-immune (T1D A). The destruction of islet beta cells in T1DA is associated with cellular oxidative stress and with the mitochondrial pathway of cell death. The aim of this study was to determine whether oxidative stress and mitochondrial dysfunction are present in T1DA experimental model NOD (non obese diabetic mouse) and if they are related to the stages of the development of the disease. The experiments were done in liver and soleus muscles biopsies, isolated liver mitochondria, spleen and circulating lymphocytes, bone marrow stem cells and isolated pancreatic islets from NOD and control Balb/c mice. NOD mice were studied at 3 stages: non-diabetic (glycemia 250 mg/dL, 14-25 weeks of age) and compared to age matched Balb/c mice. Mitochondria respiration rates (oxygen consumption) measured at phosphorylating and resting states in liver and soleus biopsies and in isolated liver mitochondria were similar in NOD at the three stages of the disease as compared to age matched Balb/c mice. However, NOD isolated liver mitochondrial were shown to be more susceptible to calcium induced mitochondrial permeability transition (MPT), as determined by calcium induced cyclosporine A sensitive swelling and by decreased calcium retention capacity. This higher MPT susceptibility was observed in all 3 stages of the development of diabetes. Hydrogen peroxide production (Amplex red) was higher in isolated liver mitochondria from non-diabetic NOD, but unaltered in pre-diabetic and diabetic NOD mice. The oxidation of H2DCF by intact cells was significantly increased in NOD lymphocytes and stem cells in non-, pre- and diabetic stages as compared to controls. In addition, we observed higher rates of H2DCF oxidation in pancreatic islets from non-diabetic NOD mice. These results suggest that the oxidative stress precedes the establishment of diabetes and may be the cause of mitochondrial dysfunction that is involved in beta cell death. We propose that oxidative stress is a key event in the pathogenesis of T1DA and may be a potential target for interventionsDoutoradoMedicina ExperimentalDoutora em Fisiopatologia Médic