Production of chitinolytic enzymes for the preparation of potentially bio-active amino-oligosaccharides

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Sueli RodriguesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia QuímicaResumo: Estudos sobre quitina e quitosana têm atraído interesse devido à sua possível conversão em oligossacarídeos, que são solúveis em água e apresentam atraentes atividades biológicas. Para este fim, métodos eficazes para a produção de amino-oligossacarídeos (AGO's) potencialmente bioativos são necessários. O trabalho objetivou estudar a viabilidade de Fermentação em Estado Sólido (FES) para a produção de um extrato enzimático adequado para a obtenção de AGO's. Inicialmente foi identificado um fungo adequado para a FES utilizando cascas de camarão como substrato, sendo uma cepa de Trichoderma polysporum selecionada. A otimização das condições da fermentação para obtenção de um extrato enzimático capaz de produzir AGO's com grau de polimerização em torno de 5, grau de polimerização considerado o mínimo adequado para bioatividades foi realizada e as enzimas produzidas por T. polysporum sob diferentes condições de fermentação (submersa e sólida) foram analisados por eletroforese, seguida pela atividade de coloração e por atividades enzimáticas utilizando substratos cromogênicos específicos. Atividades enzimáticas de ß-N-acetilglucosaminidase, quitobiosidase e uma pequena quantidade de exo-quitinase e endo-quitinase foram observadas. O extrato da FES foi utilizado para degradar parcialmente diferentes quitosanas com fração molar de N-acetilglicosamina (FA) de valor 0,27 ou 0,56, e uma quitosana cormecial com FA em torno de 0,15. Os AGO's produzidos foram caracterizados por cromatografia em camada delgada e espectrometria de massa. Uma metodologia para separação de padrões oligoméricos acetilados e desacetilados por cromatografia líquida com detecção amperométrica pulsada dos oligossacarídeos foi desenvolvida e otimizou-se a hidrólise enzimática para produção dos AGO's de quitosanas. Hetero-oligômeros bioativos com grau de polimerização entre 2 e 7 foram produzidos, apresentando atividade antimicrobiana em Pseudomonas syringae e potencializando a explosão oxidativa em células de arroz, utilizando quitosana como elicitor (ambas atividades foram encontradas em concentrações de 50 µg/mL de AGO's)Abstract: Studies on chitin and chitosan have drawn interest because of their possible conversion into oligosaccharides, which are water-soluble and present attractive biological activities. To this end, cost effective methods for the production of potentially bio-active chito-oligosaccharides (COS) are required. In this work we decided to study the feasibility of using solid state fermentation (SSF) for the production of a suitable enzyme extract for the eventual obtention of COS. The first step was the identification of a suitable fungus for solid satet fermentation (SSF) using shrimp shells as a substrate, and a strain of Trichoderma polysporum was eventually selected. The second step involved the optimisation of growth conditions to obtain enzyme preparations capable of producing COS with degrees of polymerisation of at least 5, this typically being the minimum DP for reliable bio-activities. The SSF extract was used to partially degrade different well characterised chitosans with a molar fraction of N-acetylglucosamine (FA) value of 0.27 or 0.56, and a commercial chitosan obtained from Sigma (FA around 0.15). The chitosanolytic enzymes produced by T. polysporum under different fermentation conditions were analysed by electrophoresis followed by activity staining and the enzyme activities of ß-N-acetylglucosaminidase, chitobiosidase and a small amount of exo-chitinase and endo-chitinase were observed. After hydrolysis, the complex mixture was precipitated, and the supernatant containing the COS produced was analysed using thin layer chromatography (TLC) and quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. We detected the presence of chitinase rather than chitosanase activity and the production of hetero-oligomers with degrees of polymerisation between 2 and 7. The bio-activity of these oligomer mixtures in rice plants cells and against the growth of Pseudomonas syringae was foundedDoutoradoDesenvolvimento de Processos QuímicosDoutor em Engenharia Químic