Pancreatic beta cell proliferation and dysfunction in animal model of type 2 Diabetes Mellitus. Involvement of the WNT/Beta-catenin signaling pathway

Orientador: Carla Beatriz Collares BuzatoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Tem havido um grande interesse na determinação das vias envolvidas na proliferação e função/disfunção da célula beta e a aplicação deste conhecimento em terapias moleculares e celulares da diabetes. A patogênese da diabetes melito tipo 2 (T2DM) é complexa, mas frequentemente está associada com obesidade e distúrbios do metabolismo de lipídios (hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia). A T2DM envolve o desenvolvimento de um quadro de resistência periférica à insulina parcialmente compensada por hiperinsulinemia e hiperplasia da célula beta pancreática, resultando em intolerância à glicose e hiperglicemia. Os mecanismos interligando os estados de obesidade/hipercolesterolemia e resistência à insulina ao fenômeno da hiperplasia da célula beta não são completamente conhecidos. A presente dissertação teve como objetivos: 1) caracterizar um modelo animal adequado para se estudar a proliferação e disfunção da célula beta pancreática, e 2) avaliar, no pâncreas endócrino desses animais, a possível ativação da via de sinalização Wnt/beta-catenina, conhecida por estar envolvida no processo de proliferação celular em outros tecidos/órgãos. Para tal, foram empregados camundongos C57BL/6, wild-type (WT) e knockout para receptor de lipoproteína LDL (LDLr-/-), os quais foram submetidos à dieta hiperlipídica (HF) por 60 dias. Após a dieta HF, os animais WT tornaram-se obesos e hipercolesterolêmicos, bem como moderadamente hiperglicêmicos, hiperinsulinêmicos, intolerantes à glicose e resistentes à insulina, caracterizando-os como pré-diabéticos. Além disso, os animais alimentados com dieta HF apresentaram uma diminuição significativa na resposta secretora das células beta à glicose. De modo geral, os animais LDLr-/- apresentaram uma susceptibilidade relativamente mais alta à dieta HF, sugerida pela acentuada hipercolesterolemia, intolerância à glicose, e reduzida secreção de insulina estimulada por glicose observadas nestes animais. No entanto, a dieta HF induziu, de forma semelhante em animais WT e LDLr-/-, uma diminuição significativa no conteúdo celular de Cx36, uma proteína associada à junção comunicante e um marcador de diferenciação terminal da célula beta. Ambos os grupos WT e LDLr-/- alimentados com dieta HF mostraram aumento na proliferação de células beta, como avaliada pela imunomarcação das ilhotas para a proteína Ki67, mas apenas os animais WT exibiram alterações morfométricas indicativas de hiperplasia do pâncreas endócrino, tais como aumento na massa total de ilhotas e de células beta. Uma vez estabelecido que camundongos WT alimentados com dieta HF por 60 dias consistiam em um modelo adequado para a segunda etapa deste estudo, fomos investigar a possível ativação da via Wnt/beta-catenina nas ilhotas pancreáticas desses animais, avaliando-se a distribuição e expressão celular das proteínas beta-catenina total, beta-catenina ativada, c-Myc e ciclina D. A análise por imunofluorescência para beta-catenina não mostrou acúmulo citoplasmático ou translocação para o núcleo desta proteína em ilhotas pancreáticas, que poderia indicar ativação da via Wnt/beta-catenina no nosso modelo de hiperplasia do pâncreas endócrino. No entanto, a análise por Western Blot revelou um aumento significativo na expressão de beta-catenina ativada e ciclina D em ilhotas de animais alimentados com dieta HF em relação ao grupo controle. Concluindo, a dieta HF por 60 dias induz alterações metabólicas típicas da pré-diabetes em animais WT e LDLr-/-. O estado de pré-diabetes está associado a uma diminuição da expressão de Cx36 nas células beta pancreáticas, sugerindo um possível papel da comunicação intercelular mediada pelas junções comunicantes na patogênese da T2DM. A maior susceptibilidade metabólica à dieta HF apresentada por camundongos LDLr-/-, em relação aos WT, pode ser explicada pela maior deficiência na secreção de insulina em resposta à glicose e ausência de hiperplasia compensatória do pâncreas endócrino. Ainda, a análise preliminar de expressão protéica de algumas proteínas da via Wnt/beta-catenina sugere que esta via parece estar ativada durante o processo de hiperplasia do pâncreas endócrino observada no nosso modelo animalAbstract: The pathogenesis of type 2 diabetes mellitus (T2DM) is often associated with obesity and dyslipidemia (hypercholesterolemia and hypertriglyceridemia). T2DM involves intolerance to glucose and insulin resistance partially compensated by hyperinsulinemia and pancreatic beta cell hyperplasia. The mechanisms linking obesity/hypercholesterolemia and insulin resistance to beta cell hyperplasia are not fully known. The Wnt/beta-catenin signaling pathway has been reported to be involved in cell growth and differentiation in several tissues/organs but its role in endocrine pancreas development and function is still unclear. This work aimed at: 1) establishing an appropriate animal model of T2DM to study pancreatic beta cell proliferation and dysfunction and, 2) investigating a putative involvement of the Wnt/beta-catenin signaling pathway in the beta cell hyperplasia in this model. To this end, we employed C57BL/6 wild-type (WT) and LDL lipoprotein receptor knockout (LDLr-/-) mice, fed a high fat (HF) diet for 60 days. After feeding a HF diet, WT mice became obese, hypercholesterolemic and moderately hyperglycemic, hyperinsulinemic, glucose intolerant and insulin resistant, characterizing them as pre-diabetics. Moreover, animals fed a HF diet showed a significant decrease in beta-cell secretory response to glucose. In general, LDLr-/- animals showed a relatively higher susceptibility to HF diet, as suggested by a marked hypercholesterolemia, glucose intolerance and reduced insulin secretion stimulated by glucose observed in these animals as compared to the control ones. However, HF diet induced similarly in both WT and LDLr-/- mice a significant decrease in cellular content of Cx36, a gap junctional protein and marker of terminally differentiated beta cell. Both WT and LDLr-/- fed a HF diet showed increased proliferation of beta cells, as assessed by Ki67 immunostaining, but only WT mice exhibited morphometric changes indicative of endocrine pancreas hyperplasia, such as increased total islet and beta cell masses. After we investigated a possible activation of Wnt/beta-catenin signaling pathway in these hyperplasic pancreatic islets of WT animals fed a HF diet. This was done by assessing the distribution and cellular protein expression of some proteins associated to this pathway (i.e., total and activated beta-catenin, c-Myc and cyclin D) in islets of our animal model. Beta-catenin immunofluorescence showed no cytoplasmic accumulation or translocation into the nucleus of beta cells in HF-fed mice. However, immunoblotting revealed a significant increase of unphosphorylated beta-catenin (activated) and cyclin D expression in islets of HF diet-fed animals when compared to its control group. In conclusion, a HF diet for 60d induced pre-diabetes state in both WT and LDLr-/- mice. The pre-diabetes state is associated with a decreased expression of Cx36 in pancreatic beta cells, suggesting a possible role of intercellular communication mediated by gap junctions in the pathogenesis of T2DM. The relatively high metabolic susceptibility to the HF diet showed by LDLr-/- mice, as compared to WT, may be explained by a marked impairment of glucosestimulated insulin secretion and a lack of compensatory hyperplasia of the endocrine pancreas. In addition, the protein expression analysis suggests that the Wnt/beta-catenin pathway may be activated during the islet hyperplasia process in our animal modelMestradoHistologiaMestre em Biologia Celular e Estrutura