Caracterization of the microbiol community in saline environments and their possible biotechnological applications

Orientador: Lucia Regina DurrantTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A água residuária da extração de petróleo é altamente salina e contém uma mistura complexa de hidrocarbonetos, muitos dos quais são altamente tóxicos. Com o aumento da preocupação em preservar o meio ambiente, as tecnologias voltadas para a recuperação e despoluição de áreas degradadas tem ganhado a atenção. A biorremediação tem sido utilizada como método de biodegradação natural através da otimização de processos biológicos por ser econômica, versátil e a que mais se aproxima de uma despoluição ecologicamente aceitável. No entanto, a biorremediaçao depende de alguns fatores tais como: pH, temperatura, salinidade e pressão. Condições extremas desses fatores podem matar ou inibir espécies que não estejam adaptadas a ambientes extremos, por isso o desenvolvimento e otimização de processos de biorremediação de ambientes extremos contaminados por é de grande relevância. Desta forma, este trabalho teve como objetivos o isolamento e caracterização de bactérias halofílicas presentes na água residuária da extração de petróleo, além do estudo molecular dos genes envolvidos na degradação de compostos aromáticos para que posteriormente utilizássemos essas linhagens na biorremediação desse efluente, outra vertente desse trabalho foi o estudo da diversidade microbiana presente nesta água para auxiliar o direcionamento de esforços na minimização dos impactos causados com a exploração de petróleo. Foram isoladas sete linhagens de bactérias halofílicas da água de produção de petróleo, sendo todas pertencentes a família Halomoneaceae e com potencial para degradação de compostos aromáticos. A linhagem que apresentou maior taxa de crescimento nos compostos testados (ácido benzóico, fenol, ácido p-hidroxibénzoico) foi a denominada df2. Com relação à taxa de degradação dos compostos aromáticos testados, a dp3 degradou cerca 90% do fenol disponível, seguida pela df2 que degradou 80% desse mesmo composto. Quando a fonte de carbono foi o ácido benzóico, a df1 e DP3 degradaram 99% do composto e 70% do ácido p-hidroxibenzóico foi degradado em 12 dias de experimento pela linhagem df2. Para a degradação desses compostos a linhagem Halomonas organivorans seguiu a via de degradação do catecol na rota do ß- cetoadipato compreendendo a codificaçao de diferentes enzimas por catRBCA. A comparação das seqüências da biblioteca de bactérias com as sequências do gene RNA ribossomal 16S presente nos bancos de dados GenBank e RDP revelou a presença de micro-organismos pertencentes aos gêneros Marinobacter e Halomonas e na comparação da técnica clássica de isolamento com a técnica independente de cultivo (biblioteca do gene RNA ribossomal 16S), foi encontrada uma maior diversidade na última. Finalmente de todos os testes realizados na tentativa de biorremediar a água de produção de petróleo, a bioestimulação foi a mais efetiva, sendo conseguida uma diminuição de 77% da carga orgânica com a adição de solução de fosfato e alanina. Estes resultados demonstraram o grande potencial destas linhagens para a degradação de compostos aromáticos, bem como para a biorremediação da água de produção de petróleo, além de descrever a via metabólica utilizada por membros da família Halomoneaceas na degradação de compostos aromáticos, auxiliando assim nos esforços para biorremediação de ambientes salinos contaminadosAbstract: The wastewater from oil extraction (produced water) is highly saline and contains a complex mixture of hydrocarbons, many of which are highly toxic. With increasing concern about preserving the environment, the technologies for recovery and remediation of degraded areas has been gaining attention. Bioremediation has been used as a method of natural biodegradation by optimizing biological processes because it is economical, versatile and it is the closest to a ecologically acceptable decontamination. However, bioremediation depends on factors such as pH, temperature, salinity and pressure. Extremes of these factors can inhibit or kill species that are adapted to extreme environments, so the development and optimization of bioremediation processes for contaminated extreme environments is of great importance. Thus, this work aimed at the isolation and characterization of halophilic bacteria present in the wastewater from oil extraction, and molecular studies of the genes involved with the degradation of aromatic compounds so that later we could use these strains in the bioremediation of this wastewater. Another aspect of this work was to study the microbial diversity present in this wastewater to assist in directing the efforts to minimize the impact of oil drilling. Seven strains of halophilic bacteria were isolated from of the produced water of oil production, all belonging to the family Halomoneaceae having potential for degradation of aromatic compounds. The strain that showed the highest growth rate in the tested compounds (benzoic acid, phenol, p-hydroxybenzoic acid) was strain DF2. Regarding the rate of degradation of the aromatic compounds tested, dp3 degraded about 90% of available phenol, followed by DF2 that degraded 80% of this compound. When the carbon source was benzoic acid, DP3 and df1 and degraded 99% and strain DF2 degraded 70% when the compound was p-hydroxybenzoic acid. For the degradation of these compounds the strain Halomonas organivorans followed the catechol degradation pathway ending in the formation of ß-Ketoadipate and was shown to produce various enzyme activities encoded by catRBCA. Comparison of the 16S rRNA gene sequences of the isolates with the sequences present in the GenBank and RDP databases revealed the isolates belonged to the genera Marinobacter and Halomonas. Comparing these results with those obtained by classical taxonomic techniques demonstrated that the 16S ribosomal RNA gene analysis (culture independent method), found greater diversity. Finally, of all tests performed to bioremediate the produced water, biostimulation by addition of nutrients was the most effective, and achieved a reduction of 77% of the organic load with the addition of phosphate combined with alanine. These results demonstrate the great potential of these strains for the degradation of aromatic compounds, as well as for the bioremediation of produced water from crude oil production, and describe the metabolic pathway used by members of the family Halomoneaceas for the degradation of aromatic compounds, thus assisting in efforts to develop methods for the bioremediation of contaminated saline environmentsDoutoradoCiência de AlimentosDoutor em Ciência de Alimento