Structural modification of PLA2 from Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanensis with p-bromo-phenacyl-bromide and synthetic coumarins : biochemical and biological characterization. Study of platelet aggregation and effect edema

Orientador:Marcos Hikari ToyamaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: No Brasil a espécie predominante de serpente peçonhenta do gênero Crotalus é a Crotalus durissus, que é composta por várias subespécies encontradas em todo território nacional, as subespécies alvos de nosso estudo são a Crotalus durissus ruruima e a Crotalus durissus cumanenses, presentes na região amazônica e na Venezuela respectivamente, mas que ainda não foram tão bem estudadas quanto a Crotalus durissus terrificus. As principais frações já caracterizadas para o veneno total de Crotalus são: convulxina, giroxina, crotoxina e crotamina. Através de uma combinação de varias metodologias em HPLC como exclusão molecular e em fase reversa conseguimos isolar os principais constituintes da crotoxina (PLA2, crotapotina e as proteínas "trombina-like") dos venenos totais. Durante o fracionamento do veneno total em coluna de HPLC de exclusão molecular foi detectado com atividade fosfolipásica nas frações crotoxínicas de Crotalus durissus ruruima e Crotalus durissus cumanenses sendo confirmado através de eletroforese PAGE-SDS e espectrometria de massa MALDI-TOF. As PLA2 das duas subespécies alvo apresentaram alta homegeneidade com massa molecular de aproximadamente 14kDa e mostraram uma maior quantidade de aminoácidos básicos; lisina e arginina para um total de 122 aminoácidos. O N-terminal da seqüência de aminoácidos de PLA2 mostrou homologia com outras proteínas PLA2 do gênero crotálico. A fosfolipase (PLA2) constitui o maior componente presente no veneno de serpente e tem sido extensivamente investigado não só por ser mais abundante, mas por exibir uma ampla gama de efeitos biológicos, incluindo neurotoxidade, miotoxicidade, citotoxidade, efeito edematogênico, anti-coagulante, agregação plaquetária, hipotensivo, bactericida, anti-HIV, anti- tumor e anti-parasitário. Devido a esta diversidade funcional, estas proteínas estruturalmente semelhantes despertaram o interesse de muitos pesquisadores como modelos moleculares para o estudo das relações estrutura-função. No presente trabalho foi nosso propósito purificar o veneno total de Crotalus dirussus ruruima e Crotalus durissus cumanenses, isolar a fração fosfolipásica e verificar que as atividades biológicas e bioquímicas foram afetadas após prévias modificações estruturais com p-bromofenacil brometo e cumarinas sintéticas. Os resultados apresentados neste trabalho proporcionam a obtenção de uma ferramenta bioquímica útil para acrescentar novos conhecimentos à relação entre sítios farmacológicos, região catalítica nas fosfolipases A2 e funçãoAbstract: In Brazil the predominant species of poisonous snake of the genus Crotalus is the Crotalus durissus, which is composed of several subspecies found throughout the country. The sub-targets of our study is the Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis present in the Amazon region and Venezuela respectively, that haven't been as well studied as the Crotalus durissus terrificus. The main fractions we know for the total of Crotalus poison were convulxin, giroxin, crotoxin and crotalin. Through a combination of many methodologies such as HPLC molecular exclusion and in a reverse phase we managed isolate the principal components of crotoxin (PLA2, crotapotin and proteins "thrombin-like") of the total poison. During the division of the total poison in column HPLC the molecular exclusion was detected a phospholipase activity in the fractions crotoxin Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis that confirmed through SDS-PAGE and electrophoresis of the mass MALDI-TOF. The two subspecies of PLA2 show us they are highly homogeneous with the molecular mass of almost 14kDa and a great amount of basic amino acids, lysine and arginine for a total of 122 amino acids. The N-terminal amino acid sequence of PLA2 showed homology with other proteins of the kind Crotalus PLA2. The phospholipase (PLA2) is the major component present in snake poison and has been extensively investigated not only because it is more abundant, but it shows a wide range of biological effects, including neurotoxicity, myotoxicity, cytotoxicity, edematogenic effect, anti-coagulant, platelet aggregation, hypotensive, bactericidal, anti-HIV, anti-tumor and anti-parasitic. Because of this functional diversity, these proteins structurally similar aroused the interest of many researchers as molecular models for the study of structure-function relationships. In this study our purpose was to purify the total poison of Crotalus durissus ruruima and Crotalus durissus cumanensis and isolate the fraction of phospholipase and found that the biochemical and biological activities were affected after previous structural changes with p-bromofenacil bromide and synthetic coumarins. The results presented in this work allow them to obtain a useful biochemical tool to add new knowledge to the relation between pharmacological sites, the catalytic region in phospholipases A2 and functionDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula