Smad7 and CTGF particapation on gingival myofibroblasts transdifferentation and analysis of myofibroblasts influence on oral squamous cell carcinoma proliferation and invasion

Orientador: Ricardo Della ColettaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Miofibroblastos são células mesenquimais caracterizadas pela expressão da isoforma ? da actina de músculo liso (?-SMA) e pela secreção de proteínas da matriz extracelular, fatores de crescimento e proteases. Estas células desempenham um papel importante na reparação de feridas e em processos patológicos, incluindo fibroses e cânceres. Os objetivos deste estudo foram 1) analisar o papel do fator de crescimento de tecido conjuntivo bem como o efeito da superexpressão de Smad7 na transdiferenciação de miofibroblastos gengivais induzida pelo fator de crescimento transformante-?1 (TGF-?1), 2) isolar e caracterizar linhagens celulares de miofibroblastos do estroma de carcinomas espinocelulares (CEC) orais e comparar o potencial proliferativo e produção de metaloproteinases de matriz (MMP) com linhagens celulares de fibroblastos do estroma de CEC orais, e 3) analisar a influência de miofibroblastos na modulação da proliferação e invasão de linhagens celulares de CEC oral. Nossos resultados demonstraram que o tratamento com TGF-?1 induziu simultaneamente a expressão de ?-SMA e CTGF e a neutralização de CTGF com RNA de interferência (siRNA) bloqueou o efeito de TGF-?1 na indução da transdiferenciação de células de gengiva normal em miofibroblastos. A superexpressão de Smad7 em células de GN inibiu a cascata de ativação de TGF-?1, caracterizada pela fosforilação de Smad2 e expressão de ?-SMA, CTGF e colágeno tipo I. Similarmente, miofibroblastos isolados do tecido gengival de fibromatose gengival hereditária (FGH) superexpressando Smad7 demonstraram níveis reduzidos de ?-SMA e pSmad2, além de baixos níveis de expressão de CTGF e colágeno tipo I. Três linhagens celulares de miofibroblastos foram isoladas do estroma de CEC de língua e caracterizadas pela expressão de ?-SMA e por níveis elevados de produção de colágeno tipo I. Embora o potencial proliferativo dos clones de fibroblastos e miofibroblastos tenham sido semelhantes, as produções de MMP-1, -2, -9 e -13 foram significantemente maiores em miofibroblastos. Finalmente, nós demonstramos que miofibroblastos do estroma tumoral produzem níveis elevados de alguns fatores de crescimento comparado com fibroblastos, incluindo ativina A. Meios de cultura condicionados por miofibroblastos contendo ativina A significantemente induziu a proliferação de linhagens celulares de CEC oral e uma maior progressão tumoral in vivo, enquanto que o bloqueio de ativina A por siRNA diminuiu significantemente a proliferação das células de CEC oral. In vitro, miofibroblastos induziram a invasão de linhagens celulares de CEC oral, o qual foi acompanhado por uma indução na produção de MMPs, e in vivo uma significante correlação entre presença de miofibroblastos e atividades de MMP-2 e MMP-9 foi observada. O bloqueio da síntese de ativina A por siRNA em miofibroblastos não alterou a capacidade de indução da invasão e síntese de MMPs. Os resultados deste estudo demonstram 1) que Smad7 bloqueia a transdiferenciação de miofibroblastos gengivais por meio da inibição da fosforilação de Smad2 e da transcrição de CTGF, 2) que miofibroblastos no estroma de CEC orais podem contribuir para um fenótipo mais invasivo via secreção de elevados níveis de MMPs e 3) que produtos de síntese dos miofibroblastos induzem a proliferação e invasão das células de CEC oral e os estímulos proliferativos são controlados pela produção de ativina A.Abstract: Myofibroblasts are mesenchymal cells, characterized by the specific isoform ? of the smooth muscle actin (?-SMA) expression and the extracellular matrix proteins, growth factors and proteases secretion. These cells play a central role on wound healings and in pathologic process, including fibrosis and cancers. The aims of this study were 1) analyze the connective tissue growth factor (CTGF) role and the superexpression of Smad7 effect on TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation, 2) isolate and characterize myofibroblast cell lines from oral squamous cell carcinomas stroma (OSCC) and compare the proliferative potential and matrix metalloproteinases (MMP) production with fibroblast cell lines from OSCCs stroma, and 3) analyze the myofibroblasts influence on the modulation of OSCC cell lines proliferation and invasion. Our results demonstrated that the TGF-?1 treatment induced simultaneously the ?-SMA and CTGF expression and the CTGF neutralization using the small interference RNA (siRNA) blocked the TGF-?1-induced gingival myofibroblasts transdifferentiation. Smad 7 superexpression in normal gingival cells (NG) inhibit the TGF-?1 cascade activation, characterized by the Smad2 phosphorilation and ?-SMA, CTGF and type I collagen expression. Similarly, hereditary gingival fibromatosis (HGF) myofibroblasts superexpressing Smad 7, demonstrated reduced levels of ?-SMA and phospho-Smad2, and low expression levels of CTGF and type I collagen. Three myofibroblast cell lines were isolated from tongue OSCC stroma and characterized by the ?-SMA expression and high levels of type I collagen. Although the proliferative potential of fibroblast and myofibroblast clones has been similar, the MMP-1, -2, -9 and -13 were significantly higher in myofibroblasts. Finally, we demonstrated that tumor stroma myofibroblasts produce high levels of some growth factors compared with fibroblasts, including activin A. Myofibroblasts conditioned medium containing activin A induce significantly the OSCC cell lines proliferation and a tumor progression in vivo, while the activin A dowregulation by siRNA significantly decreased the OSCC cells proliferation. In vitro, myofibroblasts induced OSCC cells invasion, accompanied by an induction of MMPs production, and in vivo was observed a significant correlation between the myofibroblasts presence and the MMP-2 and MMP-9 activity. The myofibroblasts dowregulation of activin A by siRNA did not affect the induction of invasion and MMPs synthesis. The results of this study demonstrate that 1) Smad 7 blockage the gingival myofibroblasts transdifferantiation through the inhibition of Smad 2 phosphorilation and CTGF transcription, 2) myofibroblasts on the OSCCs stroma can contribute to a more invasive phenotype via elevated levels of MMPs secretion, 3) myofibroblasts released products induce an OSCC cells proliferation and invasion and the proliferative stimulus are controlled by the activin A production.DoutoradoEstomatologiaDoutor em Estomatopatologi