Biochemical characterization of polyphenoloxidase and peroxidase of plum rubimel, cocoa pulp and study of the effect of agents anti-browning

Orientador: Hélia Harumi SatoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: A reação de escurecimento enzimático ocorre em muitas frutas e vegetais quando certos compostos fenólicos são oxidados em reações catalisadas por enzimas como polifenoloxidase (PFO) (EC 1.14.18.1) ou peroxidases (POD) (EC 1.11.1.7). A ampliação das alternativas de conservação de frutas como a ameixa nacional Rubimel, cuja produção nacional tem aumentado nos últimos anos e da polpa de cacau, uma fruta de sabor exótico e muito agradável, muito consumida no Estado da Bahia, é necessária, pois possibilita a busca por mercado consumidor dos produtos derivados dessas frutas em regiões mais distantes, preservando a qualidade da fruta in natura. Este trabalho teve como objetivo caracterizar as enzimas polifenoloxidase e peroxidase presentes nas polpas de ameixa Rubimel e de cacau e estudar o efeito de alguns agentes antioxidantes na preservação da cor natural dessas polpas. O suco de ameixa Rubimel escureceu rapidamente após a extração. O extrato enzimático bruto obtido pela centrifugação da polpa de ameixa Rubimel apresentou atividade de polifenoloxidase (448U/g de polpa) e peroxidase (705U/g de polpa). Em estudo univariável (ensaio preliminar ao estudo do efeito combinado) a PFO do extrato bruto de ameixa Rubimel apresentou atividade ótima na faixa de temperatura de 30 a 35°C e pH 6,5 e estabilidade na faixa de pH 3,0 a 7,5, após incubação durante 24h a 5ºC ou 4h a 25ºC. A enzima foi completamente inativada após tratamento térmico a 70°C por 10 minutos ou a 80°C por 1 minuto. No estudo do efeito combinado do pH e da temperatura utilizando metodologia de superfície de resposta, verificou-se que, da mesma forma que os resultados do estudo univariável, a PFO de ameixa Rubimel apresentou maior atividade em pH 6,5 e na faixa de 30 a 35°C, sendo que a enzima mostrou menor atividade em valores de pH próximos a 4,0, quando incubada a 5°C como a 65°C. Em estudo univariável (ensaio preliminar ao estudo do efeito combinado) a POD do extrato bruto de ameixa Rubimel apresentou atividade ótima a 40°C e pH 4,0 e estabilidade na faixa de pH 2,5 a 5,5, após incubação durante 24h a 5ºC ou 4h a 25ºC. A POD foi completamente inativada após tratamento térmico a 70ºC por 10minutos. No estudo do efeito combinado do pH e da temperatura utilizando metodologia de superfície de resposta, observouse que a POD de ameixa Rubimel mostrou maior atividade em pH 5,0 e a 35°C, sendo que a enzima mostrou menor atividade em valores de pH próximos a 4,0, quando incubada a 5°C como a 65°C. A adição de N-acetil-L-cisteína ou glutationa na concentração final de 5mMol/L ou a adição das combinações: 5mMol de ácido ascórbico + 1,8 mMol de 4-hexil-resorcinol ou 5 mMol de ácido ascórbico + 3,4 mMol de L-cisteína, proporcionaram uma redução de 99% na atividade da PFO de ameixa Rubimel. O extrato bruto solúvel, obtido pela centrifugação da polpa de cacau, apresentou baixa atividade de PFO (72U/g de polpa de cacau) e maior atividade de POD (668 u/g de polpa de cacau). Em estudo univariável a PFO do extrato bruto solúvel da polpa de cacau apresentou atividade ótima a 20ºC e em pH 7,0 e maior estabilidade na faixa de pH 2,6 a 10, após 24h a 5ºC ou 4h a 25ºC. A enzima apresentou 13% da atividade inicial após tratamento a 70ºC por 10 minutos, sendo completamente inativada após tratamento térmico a 80ºC por 1 minuto. Em estudo univariável a POD do extrato bruto solúvel da polpa de cacau apresentou atividade ótima a 40 ºC e em pH 5,0. O tratamento da polpa de cacau com ácido ascórbico nas concentrações de 1 a 5 mMol/L, proporcionou uma maior redução na atividade de POD entre os agentes anti-escurecimento, em todas as concentrações testadas, sendo obtida uma redução na atividade de 99% e 100%, após armazenamento por 1h e 24h a 5ºC, respectivamente, com a adição de 5mMol/L de ácido ascórbico à polpa de cacau. O tratamento térmico em ebulição por 1 minuto reduziu 99% da atividade da POD da polpa de cacau e o tratamento térmico a 70ºC da polpa de cacau contendo 3mMol/L de ácido ascórbico e posterior armazenamento durante 24h a 5ºC resultou em completa inativação da PODAbstract: The enzymatic browning reaction occurs in many fruits and vegetables when certain phenol compounds are oxidized in reactions catalyzed by enzymes such as polyphenol oxidase (PPO) (EC 1.14.18.1) and peroxidases (POD) (EC 1.11.1.7). A widening of the alternatives for the preservation of fruits such as the Rubimel plum, whose production in Brazil has increased in recent years, and of cocoa pulp, a fruit with an exotic and very agreeable taste, highly consumed in the State of Bahia, Brazil, is necessary because it enables one to search for consumer markets for products derived from these fruits in more distant regions, preserving the quality of the fruit in natura. The objective of the present work was to characterize the enzymes polyphenoloxidase and peroxidase present in the pulps of the Rubimel plum and cocoa, and study the effects of some antioxidants on the preservation of the natural color of the pulps.The juice of the Rubimel plum turns brown quickly after extraction. The crude enzymatic extract obtained by centrifugation of the Rubimel plum pulp showed PPO (448U/g of pulp) and POD (705U/g of pulp) activities. In a univariate study PPO (preliminary study preceding a study of the combined effect) the PPO in the crude extracts from the Rubimel plum showed optimum activity in the temperature range from 30 to 35°C at pH 6.5 and was stable in the pH range from 3.0 to 7.5 after 24 hours at 5°C or 4 hours at 25°C. The enzyme was completely inactivated after heat treatment at 70°C for 10 minutes or at 80ºC for 1 minute. In a study of the combined effect of pH and temperature using response surface methodology it was found that Rubimel plum PPO was most active at pH 6.5 in the temperature range from 30 to 35°C, and showed less activity at pH values close to 4.0 when incubated at 5°C and at 65ºC. In the univariate (preliminary study preceding a study of the combined effect) the POD in the crude extracts of the Rubimel plum showed greater activity at 40°C and pH 4.0 and stability in the pH range from 2.5 to 5.5, after incubation for 24h at 5ºC or 4h at 25°C. The POD was completely inactivated after heat treatment at 70°C for 10 minutes. In a study of the combined effect of pH and temperature using response surface methodology the POD of the Rubimel plum showed greater activity at pH 5.0 and 35°C, and less activity at pH values near 4 .0 when incubated at 5°C and at 65ºC. The addition of N-acetyl-L-cysteine or glutathione at final concentrations of 5 mMol/L or the addition of the combinations: 5mMol/L of ascorbic acid + 1.8 mMol/L of 4-hexyl-resorcinol or 5mMol/L ascorbic acid + 3.4mMol/L of L-cysteine, resulted in a 99% reduction in the PPO activity of the Rubimel plum. The soluble extract obtained by centrifugation of the cocoa pulp showed low PPO activity (72U/g of cocoa pulp) and high POD activity (668U/g of cocoa pulp). The PPO in the crude extract from cocoa pulp showed optimum activity at 20°C and pH 7.0, and stability in the pH range from 2.6 to 10.0, after 24 hours at 5°C or 4 hours at 25°C. The enzyme showed 13% of its initi al activity after treatment at 70°C for 10 minutes, being completely inactivated a fter heat treatment at 80°C for 10 minutes. In a univariate study the POD in the soluble crude extract from the cocoa pulp showed optimum activity at 40°C and pH 5 .0. The treatment of cocoa pulp with ascorbic acid at concentrations from 1 to 5 mMol/L, provided a greater reduction in POD activity than any of the other anti-browning agents tested, at all the concentrations tested, obtaining reductions in activity of 99% and 100%, respectively, after storage for 1 hour and 24 hours at 5°C, with the addition of 5mMol/L ascorbic acid to the cocoa pulp. Heat treatment in boiling water for 1 minute reduced the POD activity of cocoa pulp by 99% and treatment at 70°C for 30 minutes of cocoa pulp containing 3mmol / L of ascorbic acid and then stored for 24 hours at 5°C resulted in complete inactivation o f the PODDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento