Analysis of the karyotypic variation and the recombination mechanisms industrial yeast (Saccharomyces cerevisiae) during the alcoholic fermentation process

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso Gomes de AlmeidaDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O etanol de cana-de-açúcar brasileiro ocupa um lugar de destaque entre as alternativas energéticas disponíveis atualmente. No processo fermentativo de produção de etanol é utilizada a levedura Saccharomyces cerevisiae, com destaque para a linhagem industrial PE-2, utilizada por cerca de 30% das usinas brasileiras, o que representa 10% da produção mundial. Essa linhagem associa uma alta eficiência na produção de etanol com uma excelente capacidade de adaptação ao ambiente altamente hostil e competitivo das dornas de fermentação. O nosso grupo de pesquisa realizou previamente uma caracterização genética e molecular detalhada de uma linhagem diplóide derivada diretamente de PE-2 (JAY270), o que forneceu inúmeras possibilidades para a manipulação genética dessa levedura com o objetivo de desenvolver linhagens mais produtivas. No entanto, alguns estudos observaram a ocorrência de variação cariotípica nessa linhagem durante o processo fermentativo, o que pode representar uma barreira para a manipulação dessa levedura. Sendo assim, é extremamente importante estudar o comportamento do genoma dessa linhagem durante a produção de etanol. Este projeto de Mestrado teve como objetivo principal a determinação do mecanismo de recombinação genética responsável pela geração de rearranjos cromossômicos na linhagem JAY270 durante a produção de etanol. Foi realizado um experimento de fermentação em escala semi-industrial iniciado com um inóculo puro de JAY270, com duração de 50 dias. A partir de amostras coletadas ao final do processo foram obtidos isolados que foram analisados através de PFGE (Gel de Eletroforese em Campo Pulsado) para identificação de derivados de JAY270 portadores de variação cariotípica. Dos derivados analisados, 36% possuíam algum tipo de rearranjo cromossômico em relação à linhagem inicial, dos quais 11 foram selecionados (FDY1-FDY11) para análises detalhadas. As sequências genômicas de dois derivados haplóides de JAY270 possibilitaram o desenvolvimento de 9 marcadores moleculares para genotipar regiões heterozigotas de JAY270 com o objetivo de identificar eventos de recombinação genética. Os 11 isolados selecionados foram analisados com esses marcadores e, exceto por um deles, todos continuavam heterozigotos em todas as regiões genotipadas. Dois mecanismos de recombinação genética podem ser responsáveis pela geração dos rearranjos, recombinação mitótica, que ocorre em pontos isolados e recombinação meiótica, que envolve todo o genoma simultaneamente em um único ciclo celular. A possibilidade dos rearranjos terem sido gerados por recombinação meiótica foi excluída, visto que a probabilidade dos 10 isolados continuarem heterozigotos em todas as regiões analisadas após um evento de meiose seguido de cruzamento é extremamente baixa (entre 10-24 e 10-14). Sendo assim, concluiu-se que os rearranjos cromossômicos foram gerados durante o crescimento vegetativo, e que, portanto, o mecanismo de recombinação genética responsável pela geração dos mesmos é a recombinação mitótica. Os 11 isolados também foram analisados através de CGH-array, que possibilitou a comparação de sua dosagem gênica com a da linhagem JAY270, que lhes deu origem. Com essa metodologia foi possível detectar eventos de recombinação mitótica que resultaram em perda de heterozigosidade nas extremidades de alguns cromossomos.Abstract: Brazilian sugar cane ethanol stands out among the energetic alternatives available nowadays. In the fermentation process to produce ethanol it is used the yeast Saccharomyces cerevisiae. One of the most widely adopted strains is the industrial isolate PE-2, currently used by ~30% of Brazilian distilleries, generating ~10% of the world's ethanol supply. This strain combines a high performance in ethanol fermentation and an excellent adaptation to the hostile environment in the fermentation vats. Our research group previously carried out a thorough genetic characterization of an isolate of the PE-2 strain, known as JAY270. This analysis offers several opportunities for the improvement and modification of this strain. However, some studies observed the occurrence of karyotypic variation in this strain during the fermentation process, what can represent a barrier to the genetic manipulation of this yeast. Therefore, it is extremely important to study the genome behavior of this yeast during the ethanol production process. The main objective of this Master's Project was to determinate the genetic recombination mechanism responsible for generating chromosomal rearrangements in JAY270 during the ethanol production. A fermentation experiment in semi-industrial scale was carried out with a pure initial inoculum of JAY270. After 50 days, samples were collected and used to obtain single colony isolates. This isolates were analyzed through PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) to the identification of JAY270 derivatives carrying karyotypic variation. Of the analyzed derivatives, 36% had at least one chromosomal rearrangement. 11 of these derivatives were chosen to perform detailed analyses and were called FDY1-FDY11. The genome sequences of two haploid derivatives of JAY270 were used to develop 9 molecular markers to genotype heterozygous regions of JAY270 to identify genetic recombination events. The 11 isolates were analyzed with these markers and, except by one of them, all isolates were heterozygous in all genotyped regions. Two genetic recombination mechanisms can be responsible for generating the rearrangements, mitotic recombination, which occurs in isolate points of the genome, and meiotic recombination, that simultaneously affects all the genome in one single cellular cycle. The probability of the 10 isolates stay heterozygous in all genotyped regions after one event of meiosis followed by mating is extremely low (between 10-24 e 10-14). This result showed that these rearrangements couldn't be generated through meiotic recombination. Therefore, it was possible to conclude that the chromosomal rearrangements were generated during vegetative growth through mitotic recombination. The 11 isolates also were analyzed through CGH-array to compare their gene dosage with the strain JAY270. With this methodology it was possible to detect mitotic recombination events that resulted in loss of heterozygosity in peripheral regions of some chromosomes.MestradoGenetica de MicroorganismosMestre em Genética e Biologia Molecula