Identification of TH17 related cytokines in human atherosclerotic plaques

Orientadores: Maria Heloisa Souza Lima Blotta, Fábio Hüssemann MenezesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências MédicasResumo: A presença de células T ativadas em lesões ateroscleróticas confirma a sua participação na progressão da doença. Recentemente, um novo subtipo de linfócitos TCD4+ produtores de IL-17 (TH17) foi descrito e a sua associação a doenças de caráter inflamatório, bem como a sua capacidade de induzir a produção de mediadores frequentemente encontrados em lesões ateroscleróticas (IL-1?? TNF-? ??TGF-? ??CCL2 e MMP) sugerem que possam ter uma participação na aterosclerose. O objetivo do presente estudo foi investigar componentes da resposta TH17 em lesões ateroscleróticas humanas e relacioná-los a outros integrantes da resposta imunológica. Como controle foram utilizados fragmentos da artéria aorta de 3 doadores de órgãos. Para tal, avaliamos fragmentos de placas ateroscleróticas obtidas de 41 pacientes com estenose crítica de carótida, submetidos à endarterectomia. A expressão gênica e protéica de diversos mediadores foi avaliada pelo método de RT-PCR em tempo real e imunoistoquímica, respectivamente. Em alguns experimentos fragmentos de placa aterosclerótica foram submetidos à estimulação in vitro com IL-23, IL-2, LPS, PHA ou ?CD3+?CD28, para posterior análise da expressão gênica (RT-PCR) e protéica (ELISA e citometria de fluxo) de mediadores relacionados à resposta TH17. A detecção do RNAm de IL-17 se restringiu a um pequeno número de amostras e em baixa concentração, enquanto a marcação imunoistoquímica foi negativa em todas as placas analisadas. Entretanto, observamos maior expressão relativa do RNAm de mediadores relacionados à resposta TH17 (IL-23, RorC, CCR4, IL-1?, TNF-? MMP-9), à resposta TH1 e TH2 (IFN-? e GATA-3), à resposta anti-inflamatória (FoxP3, IL-10, EBI3 e IL-27R) e a mediadores com potencial citotóxico (granzima A, perforina e granulisina) em placas de pacientes do que em amostras controle. Células positivas para IL-23, IL-1?, IL-18, ICAM-1, IL-10 e TGF- ? foram encontradas com maior frequência em placas classificadas como instáveis, ricas em macrófagos, células espumosas, cristais de colesterol e focos de necrose. Finalmente, a análise da suspensão celular obtida de fragmento de lesão revelou a presença de 1% de células IL-17+, enquanto a estimulação in vitro resultou em pequena produção de IL-17 apenas após estímulo com anti?CD3+ anti-CD28. Em conjunto, os resultados mostraram a expressão de componentes da resposta TH17, em associação com mediadores da resposta TH1, TH2 e Treg em lesões ateroscleróticas humanasAbstract: The detection of activated T cells in human atherosclerotic plaques confirms their participation in the disease progression. In this scenario, IFN-? -producing T cells (TH1) are well recognized as having a pro-atherogenic role. Recently, a new subtype of IL-17-producing T helper (TH17) lineage of cells has been described and their association with inflammatory diseases, as well as their capacity to induce mediators frequently found in atherosclerotic lesions (IL-1? ? TNF-? ,?TGF-?,??CCL2 e MMP) suggest that they may have a role in atherosclerosis. The aim of this study was to investigate whether components of the immune response mediated by TH17 cells are present in human atherosclerotic lesions and their association with other immune mediators. For this purpose, 41 patients with critical stenosis of carotid submitted to endarterectomy were evaluated. Aortic fragments from organ donors were used as control. Carotid specimens were analyzed for mRNA and protein expression by real time RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. In some experiments fragments of atherosclerotic plaques were incubated in vitro with IL-23, IL-2, LPS, PHA or ?CD3+?CD28 to further evaluate mRNA and protein expression. A low number of samples showed a small expression of IL-17 mRNA, while no staining for IL-17 was detected in any of the analyzed plaques. Up-regulation of IL-17 related genes (IL-23, RorC, CCR4, CCR4, IL-1?, TNF-?, MMP-9), as well as TH1 e TH2 (IFN-? e GATA-3), anti-inflammatory mediators (FoxP3, IL-10, EBI1 e IL-27R) and cytotoxic molecules (granzyme A, perforin e granulysin) mRNA expression were detected in patients plaques compared to control arteries. In addition, unstable plaques showed a high number of IL-23, IL-1?, IL-18, ICAM-1, IL-10 e TGF- ? ??granzyme B and perforin positive cells. Finally, the analysis of plaque derived cell suspensions revealed only 1% of IL-17+ cells, while in vitro stimulation resulted in IL-17 production only in the presence of anti-CD3+anti-CD28. Altogether our results showed components of TH17 response in association with mediators of TH1, TH2 and Treg response in human atherosclerotic lesions. Further studies are ongoing to elucidate the interaction, balance and collaborative potential among these effectors lineages in atherosclerosis controlDoutoradoCiencias BiomedicasDoutor em Ciências Médica