Influence of a naturally supraorganized collagen on the peripheral nerve regeneration in vitro and in vivo

Orientador: Alexandre Leite Rodrigues de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A axotomia periférica é uma lesão que resulta na perda de continuidade do nervo lesado. No sentido de repará-la, foram desenvolvidas diversas técnicas, entre elas o autoenxerto e a tubulização com próteses de polietileno e biorreabsorvíveis. Esta última tem a vantagem de ser confeccionada com a dimensão e forma desejada, sustentar o processo regenerativo, orientando o brotamento axonal e sofrer degradação de acordo com tempo de implantação. Apesar da grande capacidade regenerativa do sistema nervoso periférico, há a dependência da expressão correta de fatores de crescimento e rearranjo dos componentes da matriz extracelular pelas células de Schwann. Um dos componentes presentes na matriz extracelular, o colágeno, pode ser produzido com organização supramolecular e ser utilizado no preenchimento de próteses biorreabsorvíveis. Devido às características positivas das próteses reabsorvíveis, a importância das células de Schwann e do colágeno, o objetivo do presente estudo foi investigar in vitro e in vivo a influência do colágeno com organização supramolecular em relação à regeneração nervosa periférica fazendo uso das técnicas de cultura purificada de células de Schwann e tubulização do nervo isquiático. No estudo in vitro foram cultivadas células de Schwann sobre o colágeno com organização supramolecular, sendo estas avaliadas através da imunocitoquímica e microscopia eletrônica de varredura. Os resultados revelaram uma cultura celular com alto grau de pureza, observados pela intensa marcação com o anticorpo anti-S-100. Além disso, observou-se que a concentração de células de Schwann foi menor no grupo com o colágeno com organização supramolecular, apesar das células de Schwann terem mantido a expressão de componentes da lâmina basal, bem como alterado sua morfologia para se ajustar na superfície do substrato. Para o estudo in vivo, foram utilizados ratos da linhagem Sprague Dawley, fêmeas e adultas divididas em 4 grupos: 1) TP - animais em que foi utilizada a prótese tubular de polietileno vazia (n=7); 2) TPCL - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=5); 3) TPCLF - animais em que foi utilizada a prótese tubular constituída de policaprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=7); 4) AE - animais que receberam autoenxerto de nervo periférico (n=5). Os resultados in vivo foram estudados através da quantificação das fibras regeneradas, morfometria dos nervos regenerados e microscopia eletrônica de transmissão 60 dias pós-cirúrgico. Além disso, o estudo in vivo incluiu análises de imunoistoquímica e microscopia de polarização 60 dias pós-cirúrgicos onde, os espécimes utilizados foram divididos em 3 grupos: 1) normal - foram utilizados nervos isquiáticos normais (n=3); 2) TPCL - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) vazia (n=3); 3) TPCLF - animais no qual foram utilizados a prótese tubular constituída de poli caprolactona (PCL) preenchida com um implante de colágeno com organização supramolecular (n=3). Observaram-se, na quantificação dos axônios, valores significativamente maiores para o grupo AE em relação aos outros grupos. Também se destacam valores superiores observados nos grupos TPCL e TPCLF comparados ao grupo TP. Quanto à morfometria, merecem ênfase os valores obtidos na espessura da bainha de mielina que exibiu diferenças estatisticamente significativas, demonstrando melhor comportamento das células de Schwann na regeneração nervosa periférica para o grupo TPCLF. Os dados de microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de polarização nos permitem considerar que a organização geral do nervo e do microambiente apresentou um padrão com analogia voltado ao nervo isquiático ileso. Ainda, os resultados referentes à imunoistoquímica, utilizando como marcador o anticorpo anti-p75NTR, demonstraram que as células de Schwann estavam mais reativas durante o processo regenerativo no grupo TPCLF comparado aos grupos TPCL e nervo isquiático ileso. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram que o implante de colágeno com organização supramolecular influenciou/estimulou significativamente o comportamento das células de Schwann tanto in vitro como in vivo.Abstract: The present study investigated in vitro and in vivo the influence of naturally supraorganized collagen on the peripheral nerve regeneration. In the in vitro study, Schwann cells (SCs) were seeded on naturally supraorganized collagen membranes and evaluated with immunocytochemistry and scanning electron microscopy. The results revealed that SCs kept the expression of basal lamina components and adjusted their morphology to populate the membrane surface. For the in vivo study, adult female Sprague Dawley rats were divided into 4 groups: 1) TP - animals that received an empty polyethylene tube (n=7); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=5); 3) TPCLF - animals in which a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment was used (n=7); 4) AE - animals in which the nerve repair was carried out with an autologous nerve graft (n=5). The in vivo results were examined by counting of myelinated axons, morphometrical analysis of regenerated fibers and transmission electron microscopy, 60 days after surgery. Moreover, the in vivo study included immunohistochemical analysis and polarization microscopy. In this case, the specimens were obtained from one of 3 groups: 1) normal - normal sciatic nerves (n=3); 2) TPCL - animals that received an empty polycaprolactone (PCL) tube (n=3); 3) TPCLF - animals in which the nerve repair was carried out with a polycaprolactone (PCL) tube filled with a naturally supraorganized collagen fragment (n=3). The counting of myelinated axons provided significantly higher values in the AE group as compared to the other groups. Also, TPCL and TPCLF groups displayed higher values when compared to TP group. Regarding the morphometrical analysis, myelin thickness was greater in TPCLF group, indicating a better SC response during the regeneration process. The data regarding transmission electron microscopy and polarization microscopy indicates that TPCLF group achieved a better reorganization of the regenerated nerve microenvironment, resembling the normal nerve morphology. The immunohistochemical results were reinforced by the anti-p75NTR labeling, that demonstrated more active SC in the TPCLF group. The present results indicate that the use of naturally supraorganized collagen positively influenced/stimulated peripheral nerve regeneration possibly by increasing the activity of SC inside the prosthesis.MestradoAnatomiaMestre em Biologia Celular e Estrutura