Development and validation of S. mutans biofilm growth model and study of effect of sucrose on gene expression of gtfBCD and dexA in dental biofilms formed in vitro and in situ

Orientador: Jaime Aparecido CuryTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Modelos in vitro e in situ tem sido desenvolvidos para o estudo do biofilme dental. Protocolos que simulem episódios de "fartura-miséria" quando açúcares da dieta estão presentes na cavidade bucal e permitam avaliação de cárie dental são necessários. Por outro lado, poucos estudos da expressão gênica de biofilmes formados in situ foram realizados. Assim, este trabalho teve como objetivos: Desenvolver e validar um modelo de formação de biofilme de S. mutans que simule episódios de "fartura-miséria" e permita avaliar mudanças no biofilme, e desmineralização do esmalte dental. Também, avaliar o efeito da sacarose na expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA de biofilme dental formado in vitro e in situ. Para os primeros objetivos, biofilmes de S. mutans UA159 cresceram durante 5 dias sobre blocos de esmalte bovino a 37oC, 10% CO2, em meio de cultura ultrapurificado, sendo avaliado: o efeito de concentração (1 a 20%) de sacarose e da freqüência (0 a 8x/dia) de exposição à sacarose. O efeito da clorexidina (0, 012 a 0,12%) 2x/dia e de NaF 0,05% foram testados para validar o modelo. Foram determinadas: viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme, biomassa e polissacarídeos; e a desmineralização do esmalte. Para o último objetivo, no estudo in vitro biofilmes de S. mutans UA159 cresceram nas mesmas condições acima citadas e foram expostos à sacarose 1% constante (controle) ou sacarose 10% 8x/dia (grupo intermitente) e após 48, 72 e 120 h os biofilmes foram coletados para análise gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. No experimento in situ, um estudo cruzado de 2 fases experimentais de 7 dias foi realizado, com 9 voluntários que usaram um dispositivo palatino contendo 12 blocos de dentina que foram submetidos 8x/dia a soluções de sacarose de 1, 5, 10 e 20%. No final, os biofilmes foram coletados para análise microbiológica, bioquímica e de expressão gênica de gtfB, gtfC, gtfD e dexA. Os resultados de padronização mostraram que as concentrações de sacarose de 10% e 20% e a frequência 8x/dia provocam mudanças no biofilme e na demineralização similares ao controle. Clorexidina mostrou efeito dose resposta, diminuindo biomassa, viabilidade bacteriana, acidogenicidade do biofilme e demineralização do esmalte, NaF 0,05% não mostrou atividade antimicrobiana, mas apresentou similar efeito a clorexidina 0,12% na redução da desmineralização. Para o último objetivo, os resultados in vitro do grupo intermitente mostraram que a expressão de genes analisados parece ser constante enquanto que no controle a expressão desses genes incrementou-se em função ao tempo. No estudo in situ, o incremento da concentração de sacarose aumentou os valores de peso úmido do biofilme, lactobacilos e polissacarídeos extracelulares do biofilme. Quanto a expressão gênica, só foi possível quantificar o gtfB e não apresentou diferenças entre os grupos. Em conclusão, o modelo in vitro apresenta potencial para avaliar o efeito antimicrobiano de substâncias sobre biofilmes e desmineralização dental. A quantificação da expressão de genes gtfB, gtfC, gtfD e dexA foi possível in vitro, mas in situ somente a expressão de gtfB foi determinada e não parece ser regulada pela concentração de sacarose.Abstract: In vitro and in situ models have been developed to study dental biofilms. Protocols, that simulate the alternations of "feast or famine" episodes that happen in oral environment in the presence of dietary carbohydrates and allowing dental caries evaluation, are necessaries. On the other hand, few studies about gene expression of dental biofilm formed in situ were performed. Thus, the objectives of this research were: To develop and to validate a model of S. mutans biofilm formation simulating 'feast-famine' episodes that allows biofilms and dental demineralization changes assessment. Also, to evaluate the effect of sucrose exposure on expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA of in vitro and in situ dental biofilms. For the first objectives, S. mutans UA159 biofilms were grown during 5 days on bovine enamel slabs at 37oC, 10% CO2 in ultra-purified culture media. To develop the model, the effect of sucrose concentration (1 - 20%) 8x/day and frequency (0 - 8x/day) exposure were evaluated and to validate the model, chlorhexidine (CHX) effect (0.012- 0.12%) 2x/day was tested. Bacterial viability, biofilm acidogenicity, biomass and polysaccharides were determined, and enamel demineralization was evaluated by surface hardness loss. To the last objective, for in vitro study, S. mutans UA159 biofilms were grown in the same conditions of previous experiments and were exposed to 1% sucrose constantly (control) or 10% sucrose 8x/day (intermittent group) and after 48, 72 and 120 h the biofilms were collected for analysis. For in situ experiment, a crossover study was conducted in two phases of 7 days each, with nine volunteers that wore intraoral palatal appliances containing 12 dental dentin slabs, which were extra orally submitted 8 times/day to sucrose solutions of 1%, 5%, 10% and 20% . On the 7th day, biofilms were collected for analysis. RNA from the in vitro and in situ biofilms were extracted and purified. Gene expression of gtfB, gtfC, gtfD and dexA were evaluated by real time PCR. In vitro development and validation results showed that 10% and 20% sucrose concentrations and frequency 8x/day provoked biofilm and enamel demineralization changes similar to control group. CHX showed dose-response effect decreasing biomass, bacterial viability and enamel demineralization (p<0.05). Also, 0.05% NaF did not show antimicrobial effect but had similar effect than 0.12% CHX decreasing enamel demineralization (p<0.05). With regard to gene expression of in vitro experiment, gene expression of intermittent group was constant along the time. In situ results showed that biofilm wet weight, lactobacillus, extracellular polysaccharides values of the biofilm increased according to the increase of sucrose exposure. No differences for gtfB gene expression between the groups were observed (p