Folate, antioxidant capacity and E-2-nonenal in Brazilian beer

Orientador: Helena Teixeira GodoyTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: No presente trabalho foram adaptados e aplicados métodos para a determinação do teor de folatos, avaliação de capacidade antioxidante e quantificação do composto trans-2-nonenal em cervejas brasileiras. Foram avaliadas 5 marcas de cervejas tipo Pilsen, sem álcool e Malzbier, nas embalagens lata e garrafa âmbar. Para determinação dos folatos (ácido fólico - AF, 10-metil-ácido fólico - 10Metil, 5-metiltetraidrofolato - 5Metil, 5-formiltetraidrofolato - 5Formil e 10-formil-ácido fólico - 10Formil) vitaminas do complexo B, empregou-se um método utilizando a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Na etapa cromatográfica utilizou-se coluna C18 e eluição por gradiente com fase móvel composta por ácido acético 2,0% ajustado a pH 2,8 e acetonitrila, a uma vazão de 0,5 mL/min. A detecção foi realizada com o detector de arranjo de diodos a 290nm para o AF e o 10Metil; e com detector de fluorescência a ?exc. 290nm e ?emis. 360nm na detecção do 5Metil e 5Formil; e a ?exc. 290nm e ?emis. 445nm para o 10Formil. Após sua validação, o método apresentou coeficientes de correlação variando de 0,9970 a 0,9999, limites de detecção de 0,07 a 2,42 mg/100mL, e de quantificação entre 0,22 e 8,07 mg/100mL. Os coeficientes de variação (CV) ficaram entre 0,75 e 5,01% e a precisão intermediária entre 1,20 e 9,99%. Os ensaios de recuperação nos níveis avaliados estiveram entre 92 e 107%. Os folatos encontrados nas cervejas analisadas foram o 10Metil, o 5Metil e o 10Formil e os níveis totais da vitamina variaram de 18,26 a 23,99 µg/100mL. Estas vitaminas foram monitoradas durante a vida de prateleira da bebida (6 meses), sendo avaliadas na cerveja recém fabricada e a cada 2 meses subseqüentes. De modo geral o teor de folatos decresceu ao longo da vida de prateleira, e não foi possível constatar o efeito do tipo de embalagem sobre a vitamina. A avaliação em diferentes lotes resultou em grande variação, com CVs de até 52,42%. Para estabelecer o teor de fenólicos totais foi aplicado o método de Folin-Ciocalteau, pelo qual foram encontrados 47,05, 18,67 e 21,83 mg/100mL em equivalentes de ácido gálico (EAG), na cerveja Malzbier, Pilsen sem álcool e Pilsen, respectivamente. O tipo de embalagem utilizada, lata ou garrafa, apresentou relevância para o teor de fenólicos totais somente para a cerveja Pilsen, e a cerveja sem álcool foi a que mais apresentou variação do teor entre marcas. Para avaliação da capacidade antioxidante foram realizados ensaios utilizando o radical 2,2- difenil -1- picrilhidrazil (DPPH) e o poder antioxidante de redução do ferro (FRAP). Os dois ensaios indicaram a cerveja Malzbier com maior capacidade antioxidante, corroborando com o teor de fenólicos totais. Para identificação e quantificação do trans-2- nonenal, um dos principais responsáveis pelo sabor envelhecido em cervejas, foi utilizado o método de headspace com microextração em fase sólida e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (HS-SPME-GC-MS). Foi utilizada coluna 5%-fenilmetilpolisiloxano (HP-5MS) e a condição cromatográfica empregada teve inicio em temperatura de 60ºC, variando 3 ºC/min até atingir 100ºC. Em seguida, uma rampa de 10 ºC/min até atingir 200ºC e permanência a 200ºC por sete minutos para limpeza da coluna. O gás de arraste (hélio) teve vazão constante de 1,0 mL/min. Os íons monitorados para a identificação (m/z) foram 55, 70 e 83 (fonte de ionização de 70eV), após verificação do espectro de massas do composto. O teor de trans-2-nonenal encontrado variou de 0,11 a 0,46 µg/L nas cervejas em lata, estando acima de seu threshold. Para este composto foi encontrada diferença significativa entre amostras de um mesmo tipo de cerveja, porém não houve diferença significativa entre os três tipos de cerveja analisados. Este trabalho demonstrou que a cerveja brasileira possui substâncias benéficas à saúde humana, com teor similar a de outros alimentos, e que o trans-2-nonenal ainda é presente em quantidades acima do threshold na bebida, podendo comprometer sua qualidade. De modo geral, a embalagem, lata ou garrafa, não influenciou no teor das substâncias analisadas e a cerveja Malzbier se destacou pela maior capacidade antioxidanteAbstract: In the present study methods were adapted and applied to quantify levels of folate, antioxidant capacity assessment and E-2-nonenal quantification in Brazilian beers. 5 brands of Pilsen, non-alcoholic and Malzbier beers were used, in can and amber bottle. For determination of folates (folic acid - FA, 10-methyl-folic acid - 10Methyl, 5-methyltetrahydrofolate - 5Methyl, 5-formyltetrahydrofolate - 5Formyl and 10-formyl-folic acid - 10Formyl) B vitamins, a method using liquid chromatography (HPLC) was employed. In the chromatographic step a C18 column was used and was applied a gradient elution with mobile phase consisting of an acetic acid 2.0% solution adjusted to pH 2.8 and acetonitrile, at a flow rate of 0.5 mL / min. The detection was performed with the diode array detector at 290nm for FA and 10Methyl, and with a fluorescence detector at ?exc. 290nm and ?emis. 360nm in the detection of 5Methyl and 5Formyl, and at ?exc. 290nm and ?emis. 445nm for the 10Formyl. After its validation, the method presented correlation coefficients ranging from 0.9970 to 0.9999 mg/100 mL, detection limits from 0.07 to 2.42 mg/100 mL and quantification limits between 0.22 and 8.07 mg/100 mL. The standard deviation (SD) was between 0.75 and 5.01% and intermediate precision was from 1.20 to 9.99%. Tests of recovery levels were resulted between 92 and 107%. Folates found in beers were 10Methyl, 5Methyl and 10Formyl. The total folate levels found among types of fresh beers ranged from 18.26 to 23.99 µg/100mL. These vitamins were monitored during beer shelf life (6 months), being evaluated in freshly brewed beer and at every subsequent 2 months. Overall levels of folate found decreased over the shelf life, but it was not possible to verify the effect of package to protect beer against degradation of the vitamins. Evaluation in different batches showed a great variation, with SD up to 52.42%. To determine the total phenolic content was applied the Folin-Ciocalteau method, by which they were found 47.05, 18.67 and 21.83 in mg/100mL equivalents gallic acid (EGA) for Malzbier beer, alcohol-free Pilsen and Pilsen, respectively. The type of packaging used, can or bottle, had relevance to the total phenolic content only for Pilsen beer. Nonalcoholic beer showed the highest variation. To evaluate the antioxidant capacity, tests using the radical 2,2 - diphenyl -1 - picrylhydrazyl (DPPH) and the ferric reduction antioxidant power (FRAP) were performed. The two tests indicated the beer Malzbier has the highest antioxidant capacity, which agrees with the content of total phenolics. For identification and quantification of E-2-nonenal, a major cause of aged flavor in beers, it was used a headspace method with micro solid phase extraction and gas chromatography technique coupled with mass spectrometry (HS-SPME-GC-MS). A 5%- phenyl-methylpolisiloxane (HP-5MS) column was used. The chromatographic conditions used beginning in temperature of 60 ºC, ranging from 3 ºC / min up to 100 ºC. Then, ramp of 10 °C / min until 200 ºC and then stay at 200 ºC for seven minutes to clean the column. The carrier gas (helium) had constant flow of 1.0 mL / min. The monitored ions were 55, 70 and 83 (m/z) (source of ionization 70eV), after verification of mass spectra of the compound. Levels of E-2-nonenal ranged from 0.11 to 0.46 µg/L in beer cans, being above its threshold. For this compound significant difference was found between samples of the same type of beer, but there was no significant difference between the three types of analyzed beer. This study showed that the Brazilian beer have beneficial substances to human health, with similar content to other food, and that the E-2-nonenal is still present in quantities above the threshold in the beverage, which can compromise its quality. In general, the packaging, can or bottle, did not influence the content of the analyzed substances, and Malzbier beer stood out for greater antioxidant capacityDoutoradoDoutor em Ciência de Alimento