Identification of microorganism present in saliva, crown and root canal of endodontically treated teeth and analysis of antimicrobial susceptibility, virulence factors and diversity of clonal types of Enterococcus faecalis isolated

Orientadores: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes, Morgana Eli ViannaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Este estudo teve como objetivos: (a) identificar microrganismos resistentes, como Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp. e enterobactérias na saliva de pacientes que apresentavam insucesso do tratamento endodôntico, (b) identificar a microbiota do material restaurador e dos canais radiculares dos mesmos, (c) verificar a suscetibilidade antimicrobiana dos Enterococcus faecalis isolados, (d) verificar os fatores de virulência e o perfil genético dos E. faecalis nos diferentes sítios examinados. Foram selecionados 42 casos clínicos de insucesso endodôntico. Coletas microbiológicas foram realizadas durante o atendimento clínico. Técnicas anaeróbicas e testes bioquímicos comerciais foram utilizados para cultivar e identificar os microrganismos. Quatorze cepas de E. faecalis isoladas de canais radiculares foram testadas quanto a suscetibilidade antimicrobiana através do método E-test. PCR (16S rRNA) foi utilizado para confirmar a identificação da espécie de E. faecalis isolados por cultura. Para os estudos de genotipagem foi realizada a extração do DNA de 74 amostras de E. faecalis com o Qiamp DNA Mini Kit. Fatores de virulência foram investigados através de primers específicos para detectar: os genes de substâncias de agregação (asa e asa373); adesinas de superfície e fatores de aderência (ace e esp); ativadores de citolosina (cylA) e gelatinase (gelE). A detecção das enzimas citolisina e gelatinase também foi realizada através de testes fenotípicos. Para o estudo da diversidade genética foi utilizado o método REP-PCR (primer ERIC) e o APPCR (primer RW3A). Na saliva os gêneros mais frequentemente identificados foram Enterococcus (62%), Staphylococcus (45%), Candida (21%) e enterobactérias (38%). A porcentagem dos gêneros bacterianos mais prevalentes nas coroas e canais radiculares foram respectivamente: Staphylococcus (31% e 43%), Streptococcus (50% e 33,3%), Enterococcus (28,6% e 33,3%), Actinomyces (23,8% e 31%) e Gemella (23,8% e 21,4%). Em relação a suscetibilidade antimicrobiana, 100% das cepas testadas (n=14) foram suscetíveis à amoxicilina + ácido clavulânico. As colônias de E. faecalis estudadas (n=74) foram positivas para a maioria dos determinantes virulentos testados. Sete diferentes genótipos (G) foram visualizados, tanto no REP-PCR como no método AP-PCR. Concluiuse que Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp. e enterobactérias foram identificados por cultura na saliva, na coroa e nos canais radiculares. O antibiótico mais efetivo foi amoxicilina + ácido clavulânico. Todas as cepas estudadas apresentaram fatores de aderência e gelatinase. Além disso, foi observada similaridade no genótipo das múltiplas colônias de E. faecalis.Abstract: The aims of this study were: (a) to identify Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp. and enterobacteria in saliva of patients with failure of the endodonticallytreated teeth, (b) to investigate the microbiota in the restorative material and within root canals of the same subjects, (c) to determine the antimicrobial susceptibility of E. faecalis strains isolated from the root canals, (d) to study the E. faecalis virulence factors, and (e) to determine the similarity of the E. faecalis genotypes from different oral sites samplings. Forty-two cases of endodontic failure were selected. Samples were collected during the endodontic procedures. Anaerobic techniques and commercial kits were used to culture and identify the microorganisms. E-test System was conducted to test the antimicrobial susceptibility of the E. faecalis isolates (n=14). PCR (16S rRNA) was used to confirm the presence of E. faecalis isolated from the saliva, restorative materials and root canals. The genotypic studies involved DNA extractions of 74 E. faecalis strains using Qiamp DNA Mini Kit. Afterwards, the virulence factors were also verified using specific primers to detect: aggregation substances (asa e asa373), adherence factors (ace e esp), cytolysin activator (cylA) and gelatinase (gelE). Phenotypic tests were also used for production of gelatinase and cytolysin. Afterwards, the REP-PCR and AP-PCR were processed to determine the genome impression. Enterococcus spp. (62%), Staphylococcus spp. (45%), Candida spp. (21%) and enterobacteria (38%) were detected in saliva. The most prevalent genera identified in crowns and root canals were: Staphylococcus (31%, 43%), Streptococcus (50%, 33%), Enterococcus (28.6%, 33.3%), Actinomyces (23.8%, 31%) and Gemella (23.8%, 21.4%), respectively. E. faecalis were 100% susceptible to amoxicillin + clavulanate. The E. faecalis strains tested (n=74) expressed most of the potential virulence factors investigated. Homogeneous E. faecalis genotypes were observed in different subjects and particularly in multiple colonies isolated from each sampling site. Seven different genotypes (G) were identified using REP-PCR and 7 among the 74 E. faecalis strains using AP-PCR. In conclusion, Enterococcus spp., Staphylococcus spp., Candida spp. and enterobacteria could also be detected in the saliva and in the root canals. The effective antibiotic for E. faecalis was amoxicillin combined with clavulanate. Adherence factors (ace) and gelatinase (gelE) were expressed in 100% of the E. faecalis. Furthermore, multiple E. faecalis showed similarity between genotypes of the same sites and subjects.DoutoradoEndodontiaDoutor em Clínica Odontológic