Effect of citrate and Vimang'TRADEMARK' treatment on experimental atherosclerosis in hypercholesterolemic LDL receptor deficient mice

Orientador: Helena Coutinho Franco de OliveiraDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A aterosclerose é uma das principais doenças causadoras de morbidade e mortalidade nas populações ocidentais. Uma das teorias mais consistentes para explicar os mecanismos celulares e moleculares da aterogênese é a chamada "hipótese oxidativa", que aponta a oxidação da LDL como evento central na gênese e no desenvolvimento das lesões. Recentemente demonstramos que camundongos geneticamente deficientes do receptor de LDL (LDLR0), modelo da hipercolesterolemia familiar humana, apresentam disfunção mitocondrial em vários tecidos, o que pode ser altamente relevante para o processo aterosclerótico. As mitocôndrias destes animais apresentam aumento de geração de espécies reativas de oxigênio (EROS) devido à diminuição de seu conteúdo de NADPH, principal poder redutor para reconstituição de seu sistema enzimático antioxidante. Propusemos que o consumo deste poder redutor do NADPH era conseqüência de uma esteroidogênese aumentada nos tecidos dos camundongos LDLR0. A deficiência mitocondrial de substratos dependentes de NADPH foi confirmada e tratamentos in vitro com isocitrato e in vivo com citrato corrigiram parcialmente o estresse oxidativo mitocondrial destes animais. Neste projeto investigamos, se o aumento de produção de EROS mitocondrial e a severidade da aterosclerose em camundongos LDLR0 poderiam ser corrigidos ou reduzidos por: 1- reposição de substratos dependentes de NADPH (citrato), e 2- tratamento com o antioxidante Vimang®, o qual tem efeito protetor em mitocôndrias desafiadas com pró-oxidantes. Em ambos os estudos utilizamos 2 protocolos de investigação das lesões ateroscleróticas: lesão induzida por dieta rica em colesterol e lesão espontânea (dieta comercial livre de colesterol). Os animais tratados com alta concentração de citrato (120 mM) e dieta com colesterol apresentaram aumento na área das lesões ateroscleróticas da raiz da aorta. Com relação às lesões espontâneas, tratamentos por longo prazo com citrato diluído (2.44 mM) ou pravastatina (10 mg/Kg), isoladamente, não tiveram efeito, enquanto a combinação de citrato+pravastatina aumentou o tamanho médio das lesões ateroscleróticas (4 vezes em relação ao grupo não tratado, p<0.05). A produção de espécies reativas de oxigênio (EROS) não diferiu em mitocôndrias de fígado dos 4 grupos, e foi mais elevada nos linfócitos de baço do grupo tratado com pravastatina. Os camundongos tratados por 2 semanas com o antioxidante Vimang® e alimentados com dieta enriquecida com colesterol, apresentaram diminuição nas concentrações plasmáticas e hepáticas de colesterol, no entanto a área de lesão aterosclerótica não diminuiu significativamente. Nos estudos com Vimang® em longo prazo e dieta isenta de colesterol foram verificados efeitos benéficos de redução de colesterolemia e da produção de EROS pelos linfócitos. No entanto, houve aumento do tamanho das lesões ateroscleróticas espontâneas. Análises de correlação univariadas com o estudo citrato, Vimang® e o conjunto de dados de ambos estudos mostraram que o tamanho médio das lesões aórticas se correlaciona positivamente com as concentrações plasmáticas de colesterol, de triglicérides, da enzima hepática fosfatase alcalina, substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), e com velocidade de oxidação de NADPH e de produção de EROS pelas mitocôndrias hepáticas, mas não com a produção de EROS pelos linfócitos do baço. Análises multivariadas demonstraram a importância dos lipídeos plasmáticos e da produção de EROS mitocondrial hepático na severidade da aterosclerose em relação aos outros parâmetros. Análise de correlação ajustada pelos valores de colesterol e triglicérides evidenciou a contribuição significativa e independente dos parâmetros indicadores de estresse oxidativo mitocondrial hepático na formação da lesão de aterosclerose. A partir destes resultados, propusemos como hipótese que o estresse oxidativo hepático tem um papel central no mecanismo de formação da lesão vascular neste modelo. Tal conexão se daria através da secreção hepática de fatores pró-aterogênicos, os quais poderiam ser de natureza inflamatória ou metabólica.Abstract: Atherosclerosis is a major cause of morbidity and mortality in the Western World. One of the main theories to explain atherogenesis is named "oxidative hypothesis". Accordingly, LDL oxidation is a central event in the genesis and development of atherosclerotic lesions. Recently, we demonstrated that LDL receptor deficient mice (LDLR0) present mitochondrial dysfunction in several tissues, which may be relevant to atherogenesis. The mitochondria of these animals present increased reactive oxygen species (ROS) generation due to decreased NADPH content, the main reducing power for the antioxidant enzymatic system. We proposed that consumption of NADPH (in the reduced state) content was a consequence of elevated steroidogenesis in the LDLR0 mice tissues. The mitochondrial deficiency of NADPH dependent substrates was directly confirmed, and isocitrate (in vitro) and citrate (in vivo) treatments partially corrected the mitochondrial oxidative stress in this model. In this project we studied whether the increase of mitochondrial ROS production and the atherosclerosis severity in the LDLR0 mice could be corrected or diminished by: 1- NADPH dependent substrates replacement (citrate), and 2- treatment with the antioxidant Vimang®, which has protective effect against pro-oxidants in mitochondria. In both studies we used 2 protocols to study atherosclerotic lesions: high cholesterol diet-induced lesion and spontaneous developed lesions (diet without cholesterol). Animals treated with high concentration of citrate (120 mM) and high cholesterol diet presented increased aorta atherosclerotic lesion areas. Regarding the spontaneous lesions study, chronic treatments with diluted citrate (2.44 mM) or pravastatin (10 mg/Kg) isolated did not affect, while the citrate+pravastatin combination increased the mean atherosclerotic lesion size (4 fold, p