Analise de metilação no promotor do gene da MMP-3 em celulas epiteliais bucais e de tecido gengival e expressão genetica em individuos com periodontite cronica fumantes e não-fumantes

Orientador: Ana Paula de Souza PardoDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: Nosso objetivo neste estudo foi investigar o padrão de metilação na posição CpG -686 do promotor da MMP-3 em células epiteliais da mucosa bucal e células do tecido gengival. Os voluntários foram divididos em três grupos: indivíduos com periodonto saudável não fumantes e indivíduos com periodontite crônica fumantes e não-fumantes. Também foi nosso objetivo analisar os níveis de expressão de RNAm da MMP-3 nestes indivíduos. Para isto, DNA foi purificado de células epiteliais bucais obtidas após bochecho com dextrose 3%. DNA e RNA foram purificados de células gengivais obtidas de biópsias de tecido gengival. O padrão de metilação na posição -686 do promotor do gene da MMP-3 foi investigado utilizando a enzima de restrição sensível à metilação HpaII, em seguida foi realizada a PCR e eletroforese. Amostras metiladas apresentaram amplificação positiva e amostras não-metiladas não apresentaram amplificação pela PCR. A análise estatística entre o padrão de metilação encontrado nas amostras dos diferentes grupos foi realizada pelo teste de c2 ao nível de 5%. A expressão relativa da MMP-3 foi analisada em aparelho real time PCR e a análise estatística foi realizada pelo teste de Kruskal-Wallis ao nível de 5%. Não foi observado diferença no padrão de metilação encontrado nas células analisadas dos diferentes grupos. A freqüência de padrão de não-metilação encontrada nas células epiteliais de mucosa bucal foi 18,3% no grupo controle, 12,5% em periodontite fumante e 9,7% em periodontite não fumante, já a taxa de nãometilação nas células do tecido gengival foi maior em todos os grupos 28% no grupo controle, 38% no grupo periodontite fumantes e 27% no grupo periodontite não-fumantes.Também não foi observada diferença na expressão genética da MMP-3 entre estes grupos. Concluímos que não há associação entre o padrão de metilação encontrado na posição -686 e a periodontite crônica em fumantes ou não-fumantesAbstract: The objective in this study was to investigate the methylation status of CpG site at position -686 of MMP-3 gene promoter in epithelial cells from oral mucosa and gingival tissue cells. Subjects were divided into three groups: nonsmokers healthy subjects and non-smokers and smokers subjects with chronic periodontitis. Another objective was also to examine the levels of mRNA expression of MMP-3 in these individuals. For this, DNA was purified from buccal epithelial cells, that were obtained after oral rinse with 3% dextrose and DNA and RNA were purified from gingival cells that were obtained from biopsies of gingival tissue. The methylation status at position -686 of MMP-3 gene promoter was investigated using the restriction enzyme sensitive to methylation HpaII, subsequently the PCR and electrophoresis was performed. Methylated samples showed positive bands after PCR and non-methylated samples showed no bands after PCR. The statistical analysis between the methylation status found in this samples in each groups was performed by c 2 test at 5% level. The relative expression of MMP-3 was examined by real time PCR and statistical analysis was performed by Kruskal-Wallis test at 5 % level. There was not difference in the methylation status found in the cells from each different group. The frequency of the unmethylated status found in the epithelial oral cells was 18,3% in healthy subjects non-smokers, 12,5 % subjects with chronic periodontitis smokers and 9,7% non-smokers. And the unmethylated status of gingival tissue cells was higher in all groups: 28% in healthy subjects non-smokers, 38% in smokers subjects with chronic periodontitis and 27% in non-smokers subjects with chronic periodontitis. Also, there was not difference in genetic expression of MMP-3 among these groups. We conclude that there is not association between the methylation status observed at position -686 of MMP3 gene promoter and chronic periodontitis in smokers and non-smokers. in all groups: 28% in healthy subjects non-smokers, 38% in smokers subjects with chronic periodontitis and 27% in non-smokers subjects with chronic periodontitis. Also, there was not difference in genetic expression of MMP-3 among these groups. We conclude that there is not association between the methylation status observed at position -686 of MMP3 gene promoter and chronic periodontitis in smokers and non-smokersMestradoHistologia e EmbriologiaMestre em Biologia Buco-Denta