Isolation of four partial cDNA sequences of genes of the carbohydrate metabolism in jatoba (Hymenaea courbaril L.) and their pattern of expression during early seedling growth

Orientadores: Marcos Silveira Buckeridge, Michel Georges Albert VincentzTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Os jatobás (espécies pertencentes ao gênero Hymenaea, família Leguminosae) apresentam grande plasticidade fisiológica. Diferentes espécies e variedades de jatobás se adaptaram a praticamente todos os biomas tropicais brasileiros, incluindo a Floresta Amazônica, e o complexo de ecossistemas que é formado pela Mata Atlântica, Cerrado e Caatinga. Espécies do gênero possuem como principal reserva de carbono do embrião o xiloglucano, um polissacarídeo similar à celulose, mas solúvel em água devido a ramificações com xilose e galactose. Após a germinação, o xiloglucano dos cotilédones é completamente degradado, produzindo monossacarídeos livres que são rapidamente metabolizados à sacarose. A produção das enzimas de hidrólise do xiloglucano nos cotilédones é controlada pela auxina proveniente da parte aérea da planta, porém, não se sabe exatamente como esse mecanismo é controlado. O objetivo deste trabalho foi isolar cDNAs (DNA complementar) parciais dos genes da bgalactosidase - BGAL e xiloglucano endotransglicosilase ou endo-b-1,4-glucanase ¿ XET, relacionados com a degradação do xiloglucano e duas enzimas envolvidas no metabolismo da sacarose, a invertase neutra/alcalina - IN/IA e a sacarose sintase ¿ SUS, para tentar avaliar possíveis formas de controle da expressão gênica envolvidas nos mecanismos do catabolismo do xiloglucano em cotilédones de plântulas de Hymenaea courbaril. Primeiramente, foram desenhados primers com base em seqüências de espécies da família Leguminosae existentes em banco de dados para os respectivos genes. A partir daí foi possível clonar seqüências parciais de todos os genes. Utilizando a técnica de RT-PCR semi-quantitativa (semi-quantitative reverse transcription-polimerase chain reaction) foram realizadas análises da expressão nos cotilédones, folhas, hipocótilos e raízes no 45º dia após a embebição (quando ocorre a taxa máxima de mobilização do xiloglucano) a cada 6 horas em um período de 24 horas. As plântulas foram analisadas sob as seguintes condições: I) plântulas crescidas em condições naturais; II) excisão da parte aérea; III) aplicação do inibidor do transporte polar de auxina (NPA ¿ ácido naftil ftalâmico); IV) crescimento em luz contínua e V) crescimento em escuro contínuo. Observou-se que existem, basicamente, três formas de controle em resposta a auxina. Nos cotilédones, os genes responsáveis pela degradação do xiloglucano BGAL1 e XTH1, possivelmente são regulados em resposta a auxina endógena e a variação de luz, enquanto que os genes responsáveis pelo metabolismo da sacarose, AlkIN1 e SUS1 possivelmente são regulados pela disponibilidade de carbono. Nas folhas, hipocótilos e raízes o padrão de expressão variou de acordo com a disponibilidade de carbono proveniente da degradação do xiloglucano de reserva nos cotilédones. Os resultados apresentados relatam a primeira descrição do isolamento dos cDNAs, permitiram a caracterização do padrão de expressão de genes chave, envolvidos no estabelecimento de uma espécie arbórea nativa do Brasil e em conjuto com os dados de atividade enzimática possibilitaram observar que a mobilização de reserva no jatobá ocorre a nível transcricional. Através do seqüênciamento, também foi possível observar que a invertase neutra clonada da raiz do jatobá apresentou resíduos de aminoácidos que a caracterizam como invertase alcalina (AlkIN1). Diante do padrão de expressão observado para a ß-galactosidase, XTH, invertase alcalina e sacarose sintase no presente trabalho, é possível sugerir um modelo para o controle da degradação e mobilização do xiloglucano de reserva nos cotilédones sob influência da auxina endógena e da variação de luz, durante o desenvolvimento inicial nas plântulas de Hymenaea courbarilAbstract: The jatobas (species belonging to the genus Hymenaea, family Leguminosae) display large physiological plasticity and as a consequence they have great adaptive capacity to several habitats. Different species and varieties of jatobas have adapted practically to all Brazilian tropical biomes, including the Amazon Forest and the complex of ecosystems that is formed by the Atlantic Forest, the Savannah and the Caatinga. Species of this genus contain xyloglucan as the main storage of carbon in their seeds. Xyloglucan is a polysaccharide similar to cellulose, but water soluble due to the branching with xylose and galactose. After germination, xyloglucan is completely degraded, producing free monosaccharides that are quickly metabolized to sucrose. The production of xyloglucan hydrolytic enzymes in the cotyledons is known to be controlled by auxin that comes from the shoot. However, it is not known how the mecanism is controlled. The aim of the present work was isolate partial cDNAs of the genes b-galactosidase (BGAL) and xyloglucan endo-transglycosylase or endo-b-1,4-glucanase (XET) xyloglucan degradation genes and two other genes related to sucrose metabolism (neutral/alkaline invertase - NI/AI and sucrose synthase - SUS) in order to try to evaluate possible forms of control of gene expression involved in the catabolism of xyloglucan in cotyledons of Hymenaea courbaril . Primers were designed on the basis of extant sequences obtained from databases for all genes. We guided the search by sequences obtained from species of the Leguminosae. We cloned partial sequences of genes coding BGAL, XTH, NI and SUS. Semi-quantitative RT-PCR (semi-quantitative reverse transcription-polimerase chain reaction) was used to analyze expression at the 45th day after imbibition (when the rate of mobilization is maximal) in cotyledons, leaves, hypocotyls and roots every 6 hours during 24 hours. The experimental treatments were 1) seedlings grown under natural conditions; II) seedlings with top shoot excised; III) seedlings treated with auxin transport inhibitor (NPA ¿ naphtyl phtalamic acid); IV) seedilings grown in continous light and V) seedilings grown in darkness. We observed that there are three mechanisms of response to auxin. In cotyledons the genes related to xyloglucan degradation, BGAL1 and XTH1, showed responses by auxin and light in the plant. The genes related to sucrose metabolism, AlkIN1 and SUS1, have shown responses to carbon flux. In leaves, hypocotyls and roots the gene pattern change according carbon source comes from product of storage xyloglucan degradation in cotyledons. Our results revealed the first description of cDNA isolation and allow characterize pattern of genes involved native Brazilian tree species establishment. Our results and enzymatic data obtained by other researchers suggest a transcriptional control of storage mobilization in jatoba. From the sequencing data, it was also possible to observe that neutral invertase (NI) gene cloned from roots of jatoba contains aminoacid residues that characterise the NI as an alkaline invertase (AlkIN1) instead. Based in degradation and mobilization of xyloglucan storage in cotyledons we propose an expression control model for ß-galactosidase, XTH, alkaline invertase and sucrose synthase in all analyzed tissues during early development in seedilings of Hymenaea courbaril by endogenous auxin influence and light alternanceDoutoradoBiologia CelularDoutor em Biologia Celular e Estrutura