Puterin, a lectin-like protein isolated from Pouteria torta seeds and its cytotoxical, insecticidal and antifungal effects

Orientador: Maria Ligia Rodrigues MacedoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Este estudo descreve a purificação e a caracterização parcial de uma nova proteína de sementes de Pouteria torta, pertencente à família Sapotaceae. A proteína foi purificada pela combinação de filtração em gel, cromatografias de troca iônica e fase reversa. PAGE-SDS da proteína purificada resultou em uma única banda de 14 kDa e aglutinou eritrócitos humanos e animais. A atividade de lectin-like foi melhor inibida pelas glicoproteínas fetuína, asialofetuina, heparina, orosomucoide e ovoalbumina. A proteína mostrou um conteúdo de carboidrato de 22 %, estabilidade entre 37- 60 ºC e pH 5.0-10.0. Pouterin teve um conteúdo relativamente extenso de aminoácidos como Asx, Glx e Leu, e também um número alto de resíduos de Cys. Pouterin inibiu o crescimento dos fungos Fusarium oxysporum, Colletotrichum musae e da levedura Saccharomyces cerevisiae. A proteína lectina-like foi avaliada em relação ao seu papel inseticida sobre C. maculatus (Coleoptera) e A. kuehniella (Lepidoptera). A incorporação de pouterin em dieta artificial (0,12 %) causou 50 % de mortalidade das larvas de Callosobruchus maculatus, enquanto que a 0,08 % pouterin produziu uma ED50. Pouterin não produziu efeitos significativos na sobrevivência larval de A. kuehnuella; entretanto, a uma ca 1 %, produziu uma redução de 71, 4 % no peso médio larval. Os resultados de utilização da dieta realizados com larvas de A. kuehniella apresentaram uma redução em ECI, ECD e AD, e um aumento no CM. Pouterin aumentou os níveis de atividade triptica no intestino médio e nas fezes das larvas de A. kuehniella. A citotoxicidade de pouterin em linhagens celulares tumorigênicas e não tumorigênicas também foram investigadas. Nós verificamos que as células tumorais HeLa, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade de pouterin de maneira dose-dependente, enquanto células Vero não tumorigênica foram relativamente resistentes a proteína. Dentre as linhagens de células tumorais, células HeLa mostraram uma maior susceptibilidade a citotoxicidade de pouterin, exibindo um aumento tempo-dependente na dosagem de LDH e um valor de IC50 de 5 µg/mL. Alterações morfológicas como arredondamento, retração citoplasmática e condensação da cromatina, consistente com morte celular apoptótica foram observados. A indução de apoptose foi demonstrada pela fragmentação de DNA como detectado pelo TUNEL. Além disso, células HeLa incubadas com pouterin mostraram rompimento do citoesqueleto de actina. Análise em western blot revelou que pouterin provocou um aumento na expressão da p21, indicando parada do ciclo celular. Estudos subseqüentes forneceram evidencias de que a apoptose pode ser parcialmente explicada pela ativação da sinalização do receptor 1 TNF (TNFR1). Interessantemente, uma diminuição tempo dependente da expressão da subunidade do fator nuclear kappa B p65 (NF?B), concomitante com a dowregulação do inibidor da proteína 1 da apoptose (IAP1) foram observados, sugerindo que a apoptose mediado pelo TNF é a via predominante induzida por pouterin em células HeLa. Nossos resultados sugerem que pouterin é uma proteína lectina-like com ampla aplicabilidade biológica, e pode ser uma ferramenta para produzir plantas transgênicas mais resistentes a patogênos e insetos utilizando técnicas de biologia molecular. Finalmente, desde que as células Hela, Hep-2 e HT-29 foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina-like, futuras investigações são necessárias, pois suas propriedades podem ser uma ferramenta útil, importante nos estudos da terapia contra o câncer humanoAbstract: This study describes the purification and characterization of a novel protein from the seeds of Pouteria torta, belong to the Sapotaceae family. The protein was purified by a combination of gel filtration, ion-exchange and reverse phase chromatographies. SDS-PAGE of the purified protein resulted in a single protein band of 14 kDa and agglutinated human and animal erythrocytes. The lectin-like activity of pouterin was best inhibited by glycoproteins such as fetuin, asialofetuin, heparin, orosomucoid and ovoalbumin. The protein showed a carbohydrate content of 22 %; stability between 37 and 60 ºC and at pH 5.0-10.0. Pouterin had a relatively large content of amino acids such as Asx, Glx and Leu, and there were also a high number of Cys residues. Pouterin inhibited the growth of the fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum musae and of the yeast Saccharomyces cerevisiae. The lectin-like protein was tested for anti-insect activity against C. maculatus (Coleoptera) and A. kuehniella (Lepidoptera). The incorporation of pouterin into an artificial diet (0.12%) caused 50% mortality in larvae of the insect Callosobruchus maculatus, whereas 0.08 % Pouterin produced an ED50. Pouterin did not produce significant effects on survival of A. kuehnuella larvae; however, at a ca 1 %, it produced a 71.4 % reduction in the average weight of the larvae. The results from dietary utilization experiments realized with A. kuehniella larvae presented a reduction in ECI, ECD and AD, and an increase in CM. Pouterin increased the level of trypsin activity in larval midgut and faeces of A. kuehniella. The cytotoxicity of pouterin in tumourigenic and non-tumourigenic mammalian cell lines also was investigated. We found that HeLa, Hep-2 and HT-29 tumor cells were highly sensitive to pouterin cytotoxicity in a dose-dependent manner, whereas non-tumourigenic Vero cells were relatively resistant to the protein. Among the tumor cell lines, HeLa cells showed the highest susceptibility to pouterin cytotoxicity, exhibiting a time-dependent increase in LDH leakage and an IC50 value of 5 µg/mL. Morphological alterations such as rounding, cell shrinkage and chromatin condensation, consistent with apoptotic cell death were observed. Apoptosis induction was demonstrated by DNA fragmentation as detected by terminal dUTP nick-end-labeling (TUNEL). Furthermore, HeLa cells incubated with pouterin showed disruption of the actin cytoskeleton. Western blot analysis revealed that pouterin caused increased expression of p21, thus indicating cell cycle arrest. Subsequent studies provided evidence that apoptosis may be partially explained in the activation of the TNF receptor 1 (TNFR1) signalling. Interestingly, a time-dependent decrease of the expression of p65 nuclear factor kappa B (NF?B) subunit, concomitant with a downregulation of the inhibitor of apoptosis protein 1 (IAP1) was observed, suggesting that TNFR-mediated apoptosis is the predominant pathway induced by pouterin in HeLa cells. Our results suggest that pouterin is a lectin-like protein with wide biological application and could be a tool for the molecular biology. The transformation of the genes coding for this lectin-like could be useful in the development of insect resistance in important agricultural crops. Finally, since Hela, Hep-2 and Ht-29 cells were highly sensitive to lectin-like-induced cytotoxicity, pouterin merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cancerDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula