NMR resolution structure of the outer membrane lipoprotein omla from Xanthomonas citri

Orientadores: Celso Eduardo Benedetti, Thelma Aguiar PertinhezTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Dentro do programa Smolbnet (Structural Molecular Biology Network) da Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), a orf (open reading frame) XAC1516 da bactéria causadora do cancro cítrico, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), foi selecionada para estudos de estrutura e função. XAC1516 codifica uma lipoproteína de membrana externa semelhante a membros da família OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) de pequenas lipoproteínas, amplamente distribuída entre as Proteobacteria 'beta¿ e 'gama¿. Apesar de se conhecer o papel de muitas lipoproteínas, nenhum membro OmlA/SmpA tem estrutura 3D (tridimensional) determinada e pouco se sabe sobre esta família do ponto de vista funcional, sendo sugerido um possível papel na manutenção da integridade do envelope celular. Curiosamente, no genoma de diversas bactérias o gene omlA apresenta localização adjacente ao gene fur (ferric uptake regulator), que codifica o principal regulador transcricional dos níveis intracelulares de ferro em bactérias Gram-negativas. O curto espaço intergênico entre omlA e fur sugere que os seus promotores são sobrepostos e que suas funções e/ou regulação podem estar associadas. Este trabalho procurou investigar a função da proteína OmlA de Xac, primordialmente através da determinação da sua estrutura 3D e análise das suas propriedades dinâmicas por Ressonância Magnética Nuclear (RMN). Também se buscou estudar a possibilidade de associação regulatória e/ou funcional entre omlA e fur, e o envolvimento do lócus no metabolismo de ferro ou na resposta ao estresse celular. Nós observamos que durante a infecção em folhas de citrus OmlA tem sua expressão aumentada em Xac e que neste processo os genes omlA e fur são co-ativados, sugerindo seu envolvimento na interação planta-patógeno. No entanto, o lócus não foi ativado em condições associadas ao metabolismo de ferro e à regulação por Fur observada em outros organismos. Ensaios de mono-híbrido foram realizados para tentar detectar possíveis fatores de ligação ao promotor do lócus omlA e fornecer informações sobre a sua regulação, mas sem sucesso. Pela primeira vez, as propriedades conformacionais e dinâmicas foram determinadas por RMN para um membro da família OmlA, e a estrutura 3D da proteína OmlA de Xac não revelou sua associação direta com processos de captação de ferro. A proteína possui extremidades desenvoveladas e uma porção central estruturada intercalada por loops flexíveis e composta de três fitas 'beta¿ e duas pequenas 'alfa¿ hélices que se empacotam num arquitetura do tipo bicamada 'alfa¿/¿beta¿. Curiosamente, este enovelamento se assemelha aos domínios da proteína BLIP (ß-lactamase inhibitory protein), um inibidor de 'beta¿-lactamase envolvido em interações proteína-proteína. Testes in vivo de co-expressão das proteínas OmlA e 'beta¿-lactamase não indicaram que OmlA possua atividade de inibição da 'beta¿-lactamase, e que portanto é provável que se associe a outra(s) proteína(s). Possíveis parceiros de interação não foram detectados através de experimentos de pull-down e coimunoprecipitação. Apesar disso, os resultados sugerem que a proteína OmlA pode estar envolvida em algum tipo de interação proteína-proteína associada à infecção na planta e sua co-ativação com fur deve fazer parte de uma resposta global relacionada à ativação de mecanismos de importância para sobrevivência de Xac durante a colonização na plantaAbstract: The XAC1516 gene from the citrus canker pathogen, Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), was selected for structural and functional studies in the context of the Fapesp Smolbnet program. XAC1516 codes for an outer membrane lipoprotein similar to members of the OmlA/SmpA (Outer membrane lipoprotein A/Small membrane protein A) family of small lipoproteins widely distributed across the 'beta¿ and 'gama¿ Proteobacteria. Although the role of numerous bacterial lipoproteins is known, the tridimensional (3D) structure of OmlA/SmpA members has never been reported and little is known about its biological function. However, it has been proposed a role of OmlA in the stability of the cellular envelope. Curiously, the omlA gene is located adjacently to the fur (ferric uptake regulator) gene, which codes for the most important transcriptional regulator of iron intracellular levels in Gram-negative bacteria. The tight intergenic spacement between omlA and fur suggests that they have superimposed promoters and that their function or regulation may be associated. In this work, we have investigated the function of the OmlA protein from Xac essentially through its 3D structure determination and dynamic analysis by Nuclear Magnetic Resonance (NMR). We also investigated the possibility of a functional association between omlA and fur and the involvement of this locus in iron metabolism or cellular stress response. We found that in Xac OmlA expression is enhanced during citrus infection and that in this process omlA and fur are co-activated, thus suggesting their involvement in plantpathogen interaction. The locus, though, was not actived upon conditions associated to iron metabolism or Fur regulation already observed in other organisms. One-hybrid assay were performed in order to detect possible transcriptional factors implicated in omlA/fur expression or repression, but without success. Conformational and dynamical properties of OmlA were determined by NMR. The protein has unfolded N and C termini and a structurally well defined core interconnected by flexible loops and composed by three 'beta¿-strands and two small 'alfa¿-helices, which pack against each other forming a two-layer 'alfa¿/¿beta¿ scaffold. Curiously, this fold ressembles the domains of BLIP ('beta¿-lactamase inhibitory protein), a 'beta¿-lactamase inhibitor involved in protein-protein interaction. OmlA and 'beta¿-lactamase co-expression in vivo experiments did not indicate that OmlA has a 'beta¿-lactamase inhibitory activity. It is possible then that OmlA associates with another protein or proteins, but interacting partners were not detected through pulldown and coimmunoprecipitation assays. Nonetheless, the results suggests that OmlA may be implicated in some sort of protein-protein interaction associated to plant infection and its coactivation with fur may take part of a global response related to activation of important mechanisms for Xac surviving during its colonization in plantDoutoradoGenetica de MicroorganismosDoutor em Genetica e Biologia Molecula