Effect of collagen derivates and bocine whey protein isolate in inhibition of gastric ulcerative lesions and tumorigenesis, in vitro e in vivo

Orientadores: Valdemiro Carlos Sgarbieri, Durvanei Augusto MariaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de AlimentosResumo: O principal objetivo deste projeto foi avaliar as propriedades fisiológicas potenciais de hidrolisados de colágeno (HC) e de um isolado protéico de soro de leite bovino (WPI) em relação aos efeitos anti-ulcerativo e anti-tumoral em roedores. O projeto apresenta uma parte tecnológica que envolve a produção do WPI e hidrolisados de colágeno (Gelita) com diferentes distribuições de massa molecular. Para obter as frações protéicas utilizadas neste estudo, responsáveis por estes atributos, uma caracterização foi conduzida por fracionamento através de microfiltração utilizando tecnologia de membranas e sistema FPLC por cromatografia de permeação em gel e de fase reversa. Estas tecnologias foram utilizadas para obtenção dos hidrolisados de colágeno com diferentes massas moleculares e do isolado protéico de soro de leite (WPI), para possibilitar a caracterização química e avaliações bioquímica/ fisiológica em suas atividades anti-úlcera e anti-tumoral. Os produtos elaborados a partir desta tecnologia de fracionamento foram caracterizados de acordo com o grau de hidrólise, composição de aminoácidos, massa molecular e número de peptídios, utilizando metodologias estabelecidas. Hidrolisados de colágeno bovino e suíno apresentaram características diferentes quanto ao grau de amidação e teor de amônio total, assim como na eletrofocalização. Os perfis cromatográficos de permeação em gel foram semelhantes, mas a atividade biológica em meio com células de melanoma B16F10 também diferiu. A combinação destas duas proteínas para avaliação dos efeitos anti-ulcerativo e anti-tumoral, também foi utilizada. Atenção especial foi dedicada a uma melhor compreensão da rota metabólica e mecanismos de ação destas duas proteínas e seus peptídios nos ensaios biológicos (modelo com ratos e camundongos, respectivamente). Para investigar o efeito anti-ulcerativo, ratos Wistar com 250-300g de peso corpóreo foram utilizados. Experimentos com dose única e repetitivas foram feitos para avaliar os efeitos destas proteínas na redução ou inibição da úlcera gástrica. A participação das substâncias sulfidrila ativas provenientes da glutationa (GSH), aminoácidos e ligações inter e intra- cadeias polipeptídicas, no mecanismo de proteção, foi estudada através da alquilação total do grupo reativo SH pela Netilmaleimida (NEM). Algumas respostas fisiológicas foram avaliadas como a produção de muco gástrico e gastrina durante o modelo experimental de úlcera induzida por etanol. A atividade inibitória em modelo de úlcera gástrica induzida por etanol foi também distinta nos hidrolisados bovino (BCH) e suínos (PCH), apresentando o hidrolisado suíno em torno de 60% de inibição das lesões ulcerativas quando administrado em dose única 750mg/Kg de peso corpóreo. No experimento de dose dupla a porcentagem de inibição das lesões ulcerativas gástricas dos hidrolisados bovinos foi maior que 70% quando administrado 1500 mg/Kg pc. Quando foram realizadas combinações de hidrolisados de colágeno bovino ou suíno com WPI, obteve-se uma combinação otimizada para BCH:WPI (50:50) na concentração de 375mg/Kg, com mais de 70% de inibição das lesões ulcerativas gástricas. Os hidrolisados de colágeno levaram ao aumento da produção de muco na mucosa gástrica e o WPI à inibição com a participação das substâncias sulfidrila não protéica na atividade inibitória das lesões gástricas. Na avaliação in vitro com as células B16F10 e os hidrolisados de colágeno bovino e suíno e suas frações obtidas por micro e ultrafiltração, assim como aquelas provenientes da cromatografia por HPLC de fase reversa, mostraram que estas últimas apresentaram a menor concentração inibitória para 50% das células (IC50), também apresentando aumento na fase de apoptose com significativo aumento na porcentagem de expressão da caspase-3 nos meios contendo as frações F1, F2 e F3. O estudo de propriedade anti-tumoral foi conduzido utilizando camundongos C57BL/6J. Animais saudáveis foram injetados (transplantados) com células tumorais de melanoma murino B16F10 na área dorsal para avaliar a implantação tumoral, progressão, caquexia observando a perda de peso e outros sintomas, metástase, capacidade proliferativa do tumor assim como sua classificação de acordo com o volume, tamanho e número. Os mecanismos nos quais a dieta protéica pode estar envolvida, avaliando a fase do ciclo celular, apoptose e efeitos anti-proliferativos no tecido tumoral foram também objetivos deste estudo. Protocolos utilizando quimioterápico foram seguidos com aquelas dietas protéicas que apresentaram melhor resposta contra a tumorigênese considerando outros mecanismos que poderiam estar envolvidos. No modelo de tumorigênese in vivo com células de melanoma B16F10 observouse uma menor porcentagem de mortalidade, maior porcentagem de sobre-vida e aspectos macroscópicos vantajosos para o grupo de animais C57BL/6J que ingeriram American Institute of Nutrition (AIN-93) tendo como fonte protéica BCH: WPI (50:50) e tratamento quimioterápico. O ciclo celular também sofreu alteração com as diferentes dietas. A fase G0/G1 tanto no grupo com tratamento quimioterápico como no grupo sem quimioterápico foi significativamente aumentada para os grupos dietéticos com BCH e BCH-P1 + WPI. A porcentagem de apoptose aumentou para BCH+WPI com tratamento quimioterápico. A capacidade proliferativa das células B16F10 diminuiu para os grupos de camundongos C57BL/6J que se alimentaram de hidrolisados de colágeno sem tratamento quimioterápico e quando houve quimioterapia associada somente aqueles grupos que receberam a combinação das duas proteínas BCH ou BCHP1 com WPI tiveram uma diminuição significativa da capacidade proliferativa das células B16F10Abstract: The main objective of this project was to evaluate the potential physiological properties of collagen hydrolysate (CH from Gelita) and a whey protein isolate (WPI) in relation to anti-ulcerative and anti-tumoral effects in rodents. The project presents a technological part, which involves the WPI production with different molecular masses. To obtain the proteic fractions used in this study responsible for these attributes, a characterization was conducted using fractionation through microfiltration using membranes technology and FPLC system through gel permeation and reverse phase chromatography. These technologies were used to obtain the collagen hydrolysate with different molecular masses and the whey protein isolate (WPI) to allow the chemical characterization and biochemical and physiological evaluations of their anti-ulcerative and anti-tumoral activities. The elaborated products obtained from these fractionation technologies and also the products from GELITA (derivatives of collagen) were characterized according to degree of hydrolysis, amino acids composition, molecular mass and peptide number, using established methodologies. Bovine and porcine collagen hydrolysates presented different characteristics concerning degree of amidation and total ammonium content, as well as in isoelectric focusing. The chromatographic profiles in gel were similar, but the biological activity in cellular medium of melanoma B16F10 also differed. Combination of these two types of proteins to evaluate anti-ulcerative and antitumoral effects were also done. Special attention was dedicated to better understanding of metabolic routes and mechanisms of action of these two proteins and their peptides in biological assays (models with rats and mice, respectively). To investigate the anti-ulcerative effect Wistar rats (250-300g bw) were used. Experiments with single and double doses were conducted to evaluate the effect of these proteins in reduction or inhibition of gastric ulcer. The participation of active sulfhydryl compounds, from gluthatione, aminoacids and inter-, intra- polypeptides chains, in protection mechanism, was studied through alkylation of SH reactive groups using N-ethylmaleimide (NEM). Some physiological responses were evaluated, as mucus and gastrin production, during experimental model of ulcer induced by ethanol. The inhibitory activity in gastric ulcer model induced by ethanol was also distinct for these two hydrolysates, bovine (BCH) and porcine (PCH). The porcine hydrolysate presented around 60% of ulcerative lesion inhibition when 750mg/Kg body weight was administrated at single dose. For double dose experiment the percentage of inhibition for bovine hydrolysate was higher than 70% when 1,500mg/Kg bw was administrated. When was tested combinations of either bovine or porcine collagen hydrolysate with WPI a optimized combination was obtained BCH:WPI (50:50) at 375mg/Kg bw of concentration presenting more than 70% gastric ulcerative lesion inhibition. The collagen hydrolysate led to increased mucus production in gastric mucosa while WPI caused in addition an inhibition by non-proteic sulfhydryl compounds participation in the inhibitory activity of gastric lesions. In vitro evaluation using B16F10 cells, the bovine and porcine collagens hydrolysates and their fractions obtained through micro and ultrafiltration, as well as those obtained by reverse phase chromatography (F1, F2, F3), showed the lowest inhibitory concentration for 50% of cells (IC50), presenting increased apoptosis percentage and a significant increase of caspase-3 expression. The study of anti-tumoral property was conducted using mice C57BL/6J. Healthy animals were injected (transplanted) with tumoral cells of murine melanoma B16F10 in dorsal area to evaluate the tumoral implantation, progression, caquexia observing the body weight loss and other symptoms, metastasis, proliferative capacity of the tumor, as its classification according to volume, size and number. The mechanisms involving the protein in the diet for evaluating cell cycle phases, apoptosis and anti-proliferative effects in tumoral tissue development were also objectives of this study. Protocols using chemotherapic were followed with protein which presented better response against tumorigenesis considering other mechanisms that could be involved. In tumorigenesis, in vivo model using B16F10 melanoma cells, a lower percentage of mortality, longer survival percentage and better macroscopic aspects were observed for C57BL/6J animal groups, fed American Institute of Nutrition (AIN-93) with BCH:WPI (50:50) as protein source plus chemotherapic treatment. The cellular cycle also suffered alteration with different diets. The G0/G1 phase for both groups treated and non-treated with chemotherapic increased significantly for the dietetic groups BCH or BCH-P1 + WPI. The apoptosis percentage increased for BCH+WPI+ChTP (with chemotherapic treatment). The proliferative capacity of B16F10 cells was reduced in the groups fed collagen hydrolysate without chemotherapic treatment and when the chemotherapic was associated only the groups that received both proteins BCH or BCH-P1 with WPI showed a significant reduction of proliferative capacity of these cellsDoutoradoNutrição Experimental e Aplicada à Tecnologia de AlimentosDoutor em Alimentos e Nutriçã