Cronic ethanol intake in the chemical hepatocarcinogenesis: immunohistochemical markers and metalloproteinases -2 and -9 activity

Orientadores: Sergio Luis Felisbino, Luis Fernando BarbisanDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: O carcinoma hepatocelular (HCC) é a quinta neoplasia humana mais freqüente no mundo e o abuso crônico do álcool é um conhecido fator de risco, embora uma direta correlação entre o consumo de etanol e o desenvolvimento do HCC permaneça incerta. O presente estudo foi delineado para avaliar os efeitos promotores diferenciais da ingestão crônica de etanol sobre a remodelação e persistência de lesões pré-neoplásicas (LPN) positivas para a forma placentária da glutationa S-transferase (GST-P) e para o fator de crescimento e transformação-alfa (TGF-a) no modelo de hepatocarcinogênese do hepatócito resistente. Noventa e quatro ratos Wistar machos com seis semanas de idade foram aleatoreamente distribuídos em cinco grupos experimentais: grupo G1, controle não-tratado com água e ração basal de livre acesso; G2, não tratado, ração equivalente ao consumo do grupo G3, e maltodextrina dissolvida em água (calorias equivalentes às fornecidas pelo etanol); G3, tratado com etanol a 5% (v/v) na água e ração basal de livre acesso; G4, dietilnitrosamina (DEN, 200 mg/kg de peso corpóreo) e 2-acetilaminofluoreno (2AAF) 200 ppm por três semanas, com ração basal equivalente ao consumo do grupo G5 e maltodextrina dissolvida na água; G5, DEN/2-AAF mais etanol 5% (v/v) e ração basal de livre acesso. Todos os animais foram submetidos à hepatectomia parcial de 70% na 3ª semana e eutanasiados na 12ª e 22ª semanas. Amostras de fígado foram coletadas e processadas histologicamente para detecção de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas e contagem de hepatócitos em apoptose em cortes corados por hematoxilina/eosina, análise imunocitoquímica para antígeno nuclear de proliferação celular ¿ PCNA, GST-P e TGF-a e para análise bioquímica de zimografia (atividade de gelatinases). Ao final do tratamento com o etanol, observou-se aumento da porcentagem da área hepática ocupada por LPN GST-P positivas do tipo persistente (P < 0,001), do número de LPN TGF-a-positivas (P< 0,001) e do número e multiplicidade de tumores hepáticos (P < 0.001) em G5, quando comparado com G4. Além disso, observou-se um aumento do índice de proliferação pelo PCNA (fase-S), mas sem alteração nos índices de apoptose, em ambas LPN em remodelação ou persistente em G5 em relação ao grupo G4 ao final da 22ª semana (P <0,001), quando comparado com G4. A atividade de gelatinases (metaloproteinases ¿2 e ¿9) no fígado não foi alterada pelo tratamento com etanol. Os resultados sugerem que a ingestão crônica de etanol promove o crescimento seletivo de LPN GST-P positivas do tipo persistente, especialmente, com associada à co-expressão de TGF-a, sem mudanças na atividades das gelatinasesAbstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most frequent cancer in the world and chronic ethanol abuse is a known risk factor, although a direct correlation between ethanol consumption and development of HCC remains uncertain. The present study was designed to evaluate the differential promoting effects of a long-term ethanol intake on remodeling/persistence of gluthatione S-transferase placental form (GST-P) and transforming growth factor alpha (TGF-a) positive preneoplastic lesions (PNL) using the resistant hepatocyte model. Six-week old male Wistar rats were randomly alocated into 5 experimental groups: G1 group, non-treated and water and chow food ad libitum; G2 group, non-treated and pair-fed chow food (restricted to match that of G2 group) and a maltodextrin solution in tap water (matched ethanol-derived calories); G3 group, drinking ethanol 5% ethanol (v/v) and solid food ad libitum;; G4 group, diethylnitrosamine (DEN, 200 mg/kg body weight) plus 200 ppm of 2-acetylaminofluorene (2AAF) for 3 weeks and pair-fed chow food (restricted to match that of G5 group) and a MD solution in tap water (matched ethanol-derived calories); G5 group, DEN/2-AAF treatments plus ethanol 5% (v/v) in tap water and chow food ad libitum. All animals were subjected to 70% partial hepatectomy at week 3 and killed at weeks 12 and 22. Liver samples were collected for histology (preneoplastic and neoplastic lesions and apoptosis detection) and immunohistochemistry (proliferating cell nuclear antigen ¿PCNA, GST-P and TGF-a) and gelatin zymography (metalloproteinases ¿2 and ¿9, also known as gelatinases, activities). At the end of ethanol treatment, there was an increase in percent of liver area occupied by persistent GST-P-positive PNL (P < 0.001), number of TGF-a-positive PNL (P< 0.001) and in number per group and multiplicity of liver tumors (P < 0.001) in DEN/2-AAF-ethanol group (G5) when compared to respective control group (G4 ¿ DEN/2-AAF). In addition, an increase in PCNA labeling indexes (S-phase), but not in the apoptosis rates, in both remodeling and persistent PNL was observed in DEN/2-AAF-ethanol group (G5) at 22 week (P <0.001), when compared to DEN/2-AAF group (G4). Liver gelatinases activities were not altered by ethanol treatment. The results suggest that chronic ethanol. Group(G) at 22 week(P