Cytotoxicity in animals cells induced by lectin from Talisia esculenta seeds

Orientadores: Maria Ligia Rodrigues Macedo, Tomomasa YanoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Lectinas constituem uma classe de proteínas ou glicoproteínas que são capazes de ligar-se, reversivelmente e seletivamente, a carboidratos sem causar transformação química. Estudos têm mostrado que a ligação de lectinas a carboidratos de superficie celular de células normais e malignas leva a vários efeitos biológicos tais como proliferação celular e apoptose. Neste trabalho, nós investigamos os efeitos citotóxicos induzidos por TEL (uma lectina, isolada de sementes de Talisia esculenta, a qual preferencialmente liga-se a resíduos de manose) sobre linhagens de células tumorais e não-tumorais. Células Vero (rim de macaco verde afiicano) e Rela (carcinoma cervical humano) tratadas com TEL exibiram perda da integridade da membrana plasmática, retração celular, condensação da cromatina, fragmentação nuclear e formação de corpos apoptóticos. Além disso, células Vero e Rela tratadas com TEL também revelaram uma drástica desorganização do citoesqueleto de actina. A Fragmentação intemuc1eossomal do DNA foi detectada pelo método de TUNEL e eletroforese em gel de agarose. Os efeitos citotóxicos induzidos por TEL foram progressivos e mostraram que as alterações morfológicas e os danos ao DNA ocorreram após a perda da integridade da membrana. Adicionalmente, TEL inibiu significantemente a proliferação das células Rela de maneira dependente da concentração. Nós também mostramos através de microscopia de tluorescência que TEL é intemalizada nas células Vero dentro de pequenas vesículas que depois se acumulam da região perinuclear; nas células Rela, a intemalização não foi observada. Foi estabelecido que a atividade das caspases-3 e -9 aumentaram nas células Vero e Rela de uma maneira dependente do tempo. Em contraste com as células Vero, a atividade da caspase-3 precedeu a ativação da caspase9 nas células Rela. Os efeitos citotóxicos e a intemalização de TEL foram bloqueados pela mano se, sugerindo que a ligação de TEL ao carboidrato específico na superficie celular é um pré-requisito para esses processos. Os resultados mostraram que a morte celular induzida por TEL nas células Vero e Rela seguiu uma série de eventos que culminou em um modo apoptótico de morte celular. Finalmente, uma vez que as células Rela foram altamente sensíveis a citotoxicidade induzida pela lectina, TEL merece futuras investigações porque suas propriedades podem ser uma ferramenta útil na terapia contra câncer cervical humanoAbstract: Lectins constitute a class of proteins or glycoproteins which are capable of binding carbohydrates selectively and reversibly without causing their chemical transformation. Studies have shown that lectin binding to cell surface carbohydrates of normal and malignants cells triggers various biological effects such as cellular proliferation and apoptosis. In this work, we investigate the cytotoxic effects induced by TEL (a lectin, isolated from Talisia esculenta seeds, which binds preferentially to mannose residues), on tumoral and non-tumoral cell lines. TEL- treated Vero (African green monkey kidney) and Hela (human cervical carcinoma) cells exhibited loss of plasma membrane integrity, cellular retraction, chromatin condensation, nuclear fragmentation and formation of apoptotic bodies. Furthermore, TEL-treated Vero and Hela cells also revealed a drastic disorganization of the actin cytoeskeleton. Internucleossomal DNA fragmentation was detected by TUNEL method. and agarose gel electrophoresis. TEL-induced cytotoxic effects were progressive and showed that the morphological alterations and DNA damage occurred after the loss of membrane integrity. Additionally, TEL significantly inhibited the proliferation of Hela cells in a concentration- dependent manner. We also show through of fluorescence microspy that TEL is internalized in Vero cells into small visicles that further coalesce in the perinuclear region; in Hela cells, TEL internalization was not observed. It was established that caspase-3 and -9 activity increased in Vero and Hela cells after TEL treatment in a time- dependent manner. In contrast to Vero cells, caspase- 3 activity preceded the activation of caspase-9 in Hela cells. The cytotoxic effects and the internalization of TEL was blocked by manose, suggesting that the binding of TELto specific carbohydrate on the cell-surface is a prerequisite for these processes. The results showed that TEL- induced cell death in Vero and HeLa cells followed by down stream events leading to apoptotic mode of cell death. Finally, since Hela cells were highly sensitive to lectin-induced cytotoxicity, TEL merits further investigation due to its properties can be a useful tool in therapy against human cervical cancerDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecula