Tabebuia avellanedae crude extract and 'beta-Lapachone induced anti-tumor response in Erhrlich tumor-bearing mice

Orientador: Mary Luci de Souza QueirozTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: Com os recentes progressos na compreensão dos complexos mecanismos moleculares relacionados a diferentes aspectos da modulação imunológica, cada vez mais vem se tornando possível ampliar os conhecimentos acerca das potenciais interferências do ponto de vista imunopatogênico induzidas pela presença e evolução tanto de processos infecciosos quanto tumorais. Modelos experimentais vêm sendo desenvolvidos e aprimorados com a finalidade de criar condições controladas para avaliações de diferentes aspectos relativos a potenciais modificações no comportamento imunológico de linhagens celulares frente à ação de novos agentes. O modelo do Tumor Ascítico de Erlich apresentou-se como uma opção de interesse, uma vez que os conhecimentos experimentais sobre diferentes aspectos relativos a sua manipulação já fazem parte de consagrada linha de pesquisa nacional. Um dos comportamentos mais recentemente estudados a seu respeito se refere a condições onde ocorre a migração do fenótipo Th1 para Th2, relacionadas ao agravamento da doença. A busca de fontes naturais para conhecimento e aplicação de novos princípios ativos vem se caracterizando como uma das mais promissoras soluções do ponto de vista farmacêutico, e pode corresponder a uma importante área de exploração da biodiversidade nacional. Dessa forma, a proposta do presente estudo foi, unindo linhas de pesquisa bastante consolidadas e conhecimentos relativos à nossa biodiversidade, avaliar o potencial terapêutico, com foco em abordagens imunopatológicas, do extrato da planta Tabebuia avellanedae (ETA) através do modelo experimental Tumor ascítico de Ehrlich. Neste trabalho investigamos os efeitos do ETA e seu constituinte isolado, a ß-lapachona (ß-lap), sobre o crescimento e diferenciação de progenitores hematopoéticos [células formadoras de colônias de granulócitos e macrófagos (CFU-GM)], a capacidade funcional das células ¿Natural Killer¿(NK) e a produção das citocinas do perfil Th1 [fator de necrose tumoral- a (TNF-a ) e interferon- ? (IFN-?)] e do perfil Th2 [interleucina (IL)-10] de animais normais e portadores do TAE. Como esperado, o TAE produziu, concomitante à mielosupressão, um aumento no número de CFU-GM esplênico. O tratamento destes animais com a dose de 120mg/kg de ETA, administrado por 7 dias após a inoculação do tumor, demonstrou uma maior eficácia, produzindo aumento na mielopoiese, redução no numero de colônias esplênicas e reversão dos fatores estimuladores de colônias (CSF) induzidos pelo TAE. Além disso, esta dose de ETA produziu a melhor eficácia na sobrevida de animais portadores do TAE, aumentando em 42% a duração da sobrevida. No entanto, doses de 30 e 500mg/kg não afetaram a mielosupressão e a hematopoese extramedular induzidas pelo tumor. O tratamento dos animais portadores do TAE com 1, 2 ou 5mg/kg de ß-lap por 3 dias após a inoculação do tumor resultou em um padrão semelhante de dose resposta, sendo a mielosupressão prevenida apenas com a dose de 1mg/kg. Interessante observar que esta dose prolongou a duração na sobrevida de animais portadores do TAE de maneira similar à dose mais eficaz do ETA, ambos em 42%. Nosso estudo também demonstrou importantes diferenças entre os tratamentos com ETA e ß-lap. Neste sentido, animais normais tratados com 2 e 5mg/kg de ß-lap apresentaram hematopoese extramedular, respectivamente 2 e 3 vezes maior que o CFU-GM de animais normais. Além disso, uma drástica mielosupressão foi observada após tratamento com ß-lap 5mg/kg, atingindo valores similares aos observados nos animais portadores do TAE e não tratados. Quanto à produção de citocinas, o tratamento com 120mg/kg de ETA impediu a polarização Th1-Th2 encontrada nos animais portadores do TAE. Neste sentido, o tratamento destes animais aumentou os níveis de secreção de TNF-a e IFN-? e reduziu os níveis de IL-10, aumentados durante a evolução temporal do TAE. O estudo da atividade funcional das células NK em animais portadores do tumor e tratados com EAT demonstrou um aumento na capacidade citotóxica das células NK, a qual se encontrava reduzida. O tratamento destes animais com ß-lap 1mg/kg impediu parcialmente a polarização Th1-Th2 em animais portadores, assim como demonstrou aumento parcial na capacidade citotóxica das células NK. Estes resultados sugerem que a eficácia antitumoral demonstrada pelo ETA pode estar relacionada com seu constituinte, a ß-lap. Por outro lado, a ausência de constituintes associados presentes no extrato bruto pode ser responsável pelos efeitos inibitórios dose-dependentes deste composto na hematopoese de animais normais. A comparação entre efeitos de um extrato vegetal e um de seus constituintes ativos isolado é outro aspecto a ser considerado, sendo importante etapa no desenvolvimento de novos fármacos de origem vegetalAbstract: In accordance with the recent progress in the understanding of immunological and molecular mechanisms related to the different aspects of immunological modulation, the improvement of knowledge about the potential interferences, at the immunopathogenic point of view, induced by the presence and evolution of infectious diseases or neoplastic process has increased. Experimental models have been developed and refined in order to create appropriate conditions to evaluate different aspects related to potential changes in the immunological behaviors of determinate cell lines with the presence of new pharmacological agents. The Ehrlich ascites tumor (EAT) model is an option of interest, since the accumulated experimental knowledge about its manipulation is part of a consolidated research line. One of its more recently studied behaviors is concerned with situations where the migration from Th1 to Th2 phenotype occurs, at the same time with the disease impairment. The search for new natural sources of pharmaceutical active principles and the careful and detailed studies about them, has been characterized as one of most promising therapeutic solutions at the moment, and would be seen as a strategic way to explore the national biodiversity. Therefore, the aim of the present study was to combine the well known techniques related to the Ehrlich ascites tumor changing behavior with a potential active principle from our botanical biodiversity, the Tabebuia avellanedae extract (TACE), in order to evaluate its immunological therapeutic potential. The effects of TACE and its isolated naphtoquinone, ß-lapachone (ß-lap), on the growth and differentiation of granulocyte-macrophage progenitor cells in normal and EAT-bearing mice were studied. Myelosupression concomitant with an increased number of spleen CFU-GM was observed in tumour-bearing mice. Treatment of these animals with the dose of 120mg/Kg TACE given for seven days after tumour inoculation elicited optimal modulatory effects on bone marrow formation and also produced a favourable response for the reduction of splenic haematopoiesis. Increased serum colony-stimulating activity induced by the tumour was also reversed with this dose-regimen. In addition, this dose-schedule showed the better efficacy in prolonging life span of EAT-bearing mice, with an extension of 42% in the duration of survival. Conversely, the doses of 30 and 500mg/kg hardly affected the myelosuppression and extramedular hematopoiesis induced by the tumor. Treatment of tumour-bearing mice with 1, 2 and 5mg/kg ß-lap given for 3 days after tumour inoculation resulted in a similar pattern of dose response, with tumour-induced myelosupression being prevented only with the 1mg/kg dose. Surprisingly, this dose-schedule prolonged the duration of survival by the same rate of 42% observed with the optimal dose of TACE. However, an important divergent response of ß-lap was its stimulating effect on the extramedular hematopoiesis of normal mice treated with the doses of 2 and 5mg/kg, which produced, respectively, 2 and 3-fold increases of CFU-GM in the spleen. In addition, in the group of normal mice exposed to the dose of 5mg/kg, a drastic reduction in the number of bone marrow CFU-GM was observed, reaching levels as low as those found in non-treated tumour bearers. We also investigated the effects of TACE and ß-lap on the natural killer cell activity (NK) and on Th1 [tumor necrosis factor- a (TNF-a ) and interferon- ? (IFN-?)] and Th2 [interleukin (IL)-10] responses in normal and EAT-bearing mice. Regarding the production of cytokines, the treatment with TACE blocked the Th1-Th2 polarization found during the EAT progression. In this respect, the treatment of these animals with TACE 120mg/kg increased the TNF-a and IFN-? levels and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. In relation to the functional activity of NK cells, the treatment with this same dose of TACE enhanced the NK cell function, reduced during the EAT growth. The treatment of these animals with ß-lap 1mg/kg produced a significant, but partial response on NK cell activity on EAT-bearing mice. In this respect, this compound only partially increased the TNF-a and IFN-? levels and reduced the levels of IL-10, increased during the temporal evolution of EAT. These findings suggest that the antitumoral efficacy demonstrated by the crude extract of T. avellanedae might be related to its constituent, the ß-lapachone. On the other hand, the absence of the associated constituents present in the crude extract might be responsible for the dose-dependent inhibitory effect of this biosynthetic compound on normal murine hematopoiesis. The comparison between a total vegetal extract and some of its isolated compounds remain another significant aspect in phytochemical research, specially focused in new medicines discoveryDoutoradoMedicina ExperimentalDoutor em Fisiopatologia Medic