Effect of PD 153035, a tyrosine kinase inhibitor, on insulin signaling and glucose metabolism

Orientador: Mario Jose Abdalla SaadDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: Estudos recentes demonstraram que tratamentos prolongados com drogas inibidoras da atividade tirosina quinase (TKI) poderiam agir favoravelmente não só controlando crescimento e replicação celular, como também funções fisiológicas responsáveis por manter a homeostase da glicose. Porém, os efeitos diretos de PD 153035, um TKI, na regulação das etapas iniciais da ação da insulina não são conhecidos. A insulina, ao se ligar à subunidade a de seu receptor heterotetramérico, dá início a uma série de ações imediatas e tardias, metabólicas e promotoras de crescimento .Tais eventos ocorrem através da estimulação da subunidade ß transmembrana do receptor, que autofosforila e ativa a fosforilação de substratos endógenos intracelulares, conhecidos como substratos do receptor de insulina ou IRSs. Os principais substratos do receptor de insulina são o IRS-1 e IRS-2, que quando fosforilados em tirosina se ligam e ativam proteínas com porção SH2, como a PI 3-quinase. A ativação destas proteínas desencadeia a ativação de suas serinas-quinases importantes que são a AKT e as ERKs (1/2), que são essenciais, respectivamente, para os efeitos metabólicos e de controle gênico do homônio. No presente estudo investigamos o efeito do tratamento com PD 153035, por 7 dias, na sensibilidade e sinalização da insulina em fígado, musculo e tecido adiposo de ratos Wistar. Foi investigado o grau de fosforilação em tirosina do receptor de insulina, dos substratos 1 e 2 do receptor ( IRS-1 e IRS-2 ), a associação deles com a enzima PI 3-quinase, o grau de fosforilação em serina/treonina da AKT, a fosforilação das ERKs (1/2), da p70s6k, da AMPK, da JNK e I?Ba nos três tecidos. Nenhuma diferença nos níveis glicêmicos foi observado durante o GTT entre os grupos tratado com PD 153035 e controle. As taxas de desaparecimento de glicose plasmática estavam altas nos animais tratados. No fígado de ratos tratados com PD 153035, observamos um aumento da fosforilação em tirosina do IR, IRS-1 e do IRS-2 e um aumento da associação desses substratos com a PI 3-quinase. Porém uma diminuição significativa da fosforilação da AKT e da p70s6k foi observada, sem alteração no grau de fosforilação das ERKS (1/2). Não foi observado diferença significativa no grau de fosforilação da JNK, porém os animais tratados apresentaram uma redução significativa nos níveis de I?Ba . O grau de fosforilação da AMPK mostrou-se aumentado nos animais tratados. Quando estudamos o tecido muscular, após estímulo agudo com insulina observamos uma diminuição significativa no grau de fosforilação do receptor de insulina nos animais tratados com PD 153035. Entretanto, nesses animais, pudemos observar após estímulo agudo com insulina, que a fosforilção em tirosina do IRS-1 aumentou significativamente. O aumento da fosforilação do IRS-1 foi acompanhada pelo aumento na associação IRS-1/ PI 3-quinase e pelo aumento no grau de fosforilação da AKT e da p70s6k. a. O grau de fosforilação da AMPK mostrou-se aumentado nos animais tratados. Não foi observada alteração no grau de fosforilação das ERKs (1/2) neste tecido. Foi observado uma redução do grau de fosforilação das serinas quinases JNK e I??a no músculo dos animais tratados. Os animais que receberam tratamento crônico com PD 153035 por 7 dias apresentaram uma redução da adiposidade visceral, bem como uma perda de peso em relação ao grupo controle. Observamos nesses animais uma redução significativa no grau de fosforilação do IR e do IRS-1 no tecido adiposo. A associação IRS-1/PI 3-quinase mostrou uma redução significativa. A fosforilação da AKT e da P70s6k mostrou-se significativamente reduzida nos animais tratados. Entretanto observamos um aumento significativo da fosforilação do IRS-2 após estímulo insulínico agudo, porém acompanhado pela redução significativa na associação IRS-2/PI 3-quinase. Não observamos diferença nos níveis de fosforilação das ERKs. Observamos que o grau de fosforilação da proteína AMPK aumentou significativamente no ratos que receberam tratamento com PD 153035. Foi observado uma redução significativa do grau de fosforilação da JNK e I??a no tecido adiposo dos animais tratados. Sumariamente, o tratamento com PD 153035 por 7 dias aumentou a fosforilação em tirosina do IR, IRS-1 e IRS-2 no fígado, apesar da fosforilação da AKT apresentar-se reduzida neste tecido. No músculo dos animais tratados com PD 153035 observamos que a droga melhora a sinalização da insulina, provavelmente pela redução da atividade das serinas quinases JNK, IKKß e mTOR. No tecido adiposo a droga induziu resistência à insulina, acompanhada de redução no ganho de peso e redução da adiposidade visceral, possivelmente pelo aumento da secreção de adiponectina pelos adipócitos. Em conclusão, os resultados do nosso estudo demonstram que o tratamento com PD 153035 aumentou a sensibilidade à insulina, por aumento da adiponectina, aumento da AMPK em fígado, músculo e adiposo, e aumentada via IRS/PI3K/AKT em músculoAbstract: It has been recently demonstrated that long-term treatment with some of tyrosine kinase inhibitor (TKI) drugs, might favorably act at steps in controlling not only cell growth and replication, but also physiological functions responsible for maintaining glucose homeostasis. However, the direct effects of PD 153035, a TKI, in the regulation of the early steps of insulin action are not known. Insulin initiates its growth and metabolic promoting effects by biding to its receptor at the plasma membrane, which has tyrosine-kinase activity, and is able to autophosphorylates and phosphorylates cytoplasmatic proteins called insulin receptor substrates (IRSs). The main substrates of insulin receptor are IRS-1 and IRS-2, which when phosphorylated in tyrosine bind and activate several proteins, including phosphatidylinositol (PI) 3-kinase. These initial steps lead to the activation of two serine/threonine kinases ¿ AKT and ERK family (1/2) of MAPK. In the present study, we investigated the effect of treatment with PD 153035, for 7 days, on insulin sensitivity and insulin signaling in liver, muscle and adipose tissue of Wistar rats. It was investigated the tyrosine phosphorylation of IR, IRS-1 and IRS-2, their association with PI 3-kinase, and Akt serine/threonie phosphorylation , ERKs (1/2) phosphorylation, p70s6k, AMPK, JNK and ???a phosphorylation, in the three tissues. No differences in fasting plasma glucose levels were observed in animals treated with PD 153035. Plasma glucose disappearance rates were higher in treated animals In the liver of rats treated with PD 153035, we observed an increased IR, IRS-1 and IRS-2 tyrosine phosphorilation and an increased association of these substracs with PI 3-quinase. However a significant decrease of AKT and of the p70s6k phosphorylation was observed too, without alteration in ERKs phosphorylation levels (1/2). No significant difference was observed in JNk phosphorylation levels, however ??? showed a reduced phosphorylation in the liver of these animals. AMPK showed a significant increased phosphorylation in treated animals. When we studied muscle, insulin-induced IR tyrosine phosphorylation showed significantly reduced in these animals, however treating rats with PD153035 significantly increased the insulin-induced IRS-1 phosphorylation in the muscle. The increased phosphorylation of IRS-1 was accompanied by increase in IRS-1/PI3-kinase association and Akt and p70s6k phosphorylation were higher in treated animals after insulin stimulation. AMPK showed a significant increased phosphorylation in treated animals. There was no significant changes in ERKs (/2) phosphorylation in this tissue. Reduced phosphorylation of serine-kinases as c-jun N terminal (Jnk) and I?kß was observed. The animals that received chronic treatment with PD 153035 for 7 days had presented a reduction in visceral fat mass, as well as a loss of weight, regarding the control group We observed in these animals a significant decreased IR and IRS-1 tyrosine phosphorylation in the adipose tissue. The association IRS-1/PI3-kinase showed a significant reduction. AKT and P70s6K phosphorylation showed significantly decreased in treated animals. However we observe a significant increased phosphorylarion of insulin-induced IRS-2 phosphorylation, but the association IRS-2/PI 3-kinase showed a significant reduction. We did not observe any difference in phosphorylation levels of ERKs (1/ 2). AMPK phosphorylarion increased significantly in animals that received treatment with PD 153035. Reduced phosphorylation of JNK and Ikkßa was observed in adipose tissue of treated animals. In summary, our results demonstrated that in 7 days of treatment with PD 153035 increased tyrosine phosphorylation of IR/IRS-1/IRS-2 in the liver were observed, in spite of AKT phosphorylation had decreased in this tissue. In muscle of animals treated with PD 153035 we observed that the drug had improved the insulin signalling, probably by reduction of the serine kinase activity JNK, ???ß and mTOR. In the adipose tissue, the drug induced insulin resistance, accompanied of visceral fat mass reduction as well as a loss of weight, probably due to an increased adiponectin secretion by fat cels. In conclusion, the results of our study demonstrate that the treatment with PD 153035 increased the insulin sensibility, by increased levels of adiponectin, increased AMPK in liver, muscle and adipose tissue, and increased IRS/PI3K/AKT pathway in muscleMestradoCiencias BasicasMestre em Clinica Medic